有柄石韦水提物对小鼠皮肤全层切除伤的促愈合作用*

孔祥耀， 于世博， 黎小梅， 唐　毅， 倪　稳， 陈明翠， 张金娟

(贵州医科大学 化学与生物化学实验室， 贵州 贵阳　550004)



有柄石韦水提物对小鼠皮肤全层切除伤的促愈合作用*

孔祥耀， 于世博， 黎小梅， 唐毅， 倪稳， 陈明翠， 张金娟**

(贵州医科大学 化学与生物化学实验室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究有柄石韦孢子叶(SPP)水提物对小鼠全层切除伤的影响。方法： 对75只昆明小鼠做背中线100 mm2的全层皮肤切除制作模型；随机均分成空白组、云南白药组和有柄石韦组，云南白药组和有柄石韦组分别给予云南白药粉末和有柄石韦提取物敷于伤口，连续给药5 d；计算造模后第1～3天，第3～7天，第7～14天和第14～18天伤口缩小比例；于造模后第3、7及18天取处死小鼠，取背部皮肤组织行HE染色，观察3组小鼠伤口皮肤肉芽组织生长情况和再上皮化程度。结果： 云南白药组和有柄石韦组在第1～3天、第3～7天、第7～14天和第14～18天时段的伤口缩小比例均大于对照组(P<0.05)；云南白药组在第1～3天、第3～7天和第14～18天时段的伤口缩小比例高于有柄石韦组(P<0.05)；造模后第3天，云南白药组和有柄石韦组的肉芽组织较对照组组织规则厚实；第7天时，云南白药组和有柄石韦组的肉芽组织厚度增加，较为紧凑，无水肿现象，成纤维细胞数量明显增高；第18天时，3组小鼠组伤口基本愈合，但云南白药组和有柄石韦组的伤口愈合后组织较对照组紧致，无水肿现象。结论： 有柄石韦能促进小鼠伤口愈合，作用稍弱于云南白药。

[关键词]云南白药； 伤口愈合； 肉芽组织； 小鼠; 有柄石韦

伤口愈合是一个进化上相对保守、复杂、多细胞参与的过程，是皮肤屏障的重建过程。这个过程涉及了角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞以及血小板等多种细胞的共同作用。这些细胞的转移、增殖、浸润和分化将会在炎症反应、新组织的形成以及伤口愈合中达到顶峰[1]。有柄石韦(Pyrrosiapetiolosa)是水龙骨科石韦属下的蕨类植物，《苗药》中记载为黛口掌，锐猫棍，多用于治疗肺癌、膀胱癌、肾炎、膀胱炎、肾结石、血尿、咳血、衄血以及哮喘。石韦属植物主要成分为黄酮类化合物，对常见的革兰阳性细菌如金黄色葡萄球菌及革兰阴性菌如大肠埃希菌等均有一定的抑菌效果[2-4]。贵州民间多把此药用于止血和促进伤口愈合，效果显著。本文用有柄石韦孢子叶粉碎后粉末的水提物处理以小鼠皮肤全层切除伤，观察有柄石韦对伤口愈合的作用。

1材料与方法

1.1试药与试剂

试药为有柄石韦，采摘于贵州当地，并于贵州医科大学天然产物化学重点实验室鉴定。取其孢子叶于贵州医科大学药学院天然药物化学实验室100目粉碎机粉碎，采用水提法进行有柄石韦水提物制备；试剂有95%无水酒精、碘伏、3%戊巴比妥钠溶液、10%中性甲醛固定液及HE染液；RM2015型石蜡切片机(德国莱卡公司)，DSHZ-300型恒温水浴箱(江苏太仓)，BX51T-PHD-J11型显微镜(日本奥林巴斯)。

1.2方法

1.2.1动物分组及造模健康SPF级昆明雄性小鼠75只，体质量(20±3)g，由贵州医科大学动物中心提供，使用许可证号为SCXK(黔)2014-001。随机均分成对照组、云南白药组和有柄石韦组，每组又随机均分成第1、3、7、14及18天5个小组。造模：小鼠适应性饲养3 d后，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，背部去毛，于每只小鼠背部脊柱正中线做100 mm2大小的全层皮肤切除(不损伤筋膜层)；术后对照组伤口不给于任何措施，云南白药组给予云南白药粉末，有柄石韦水提组给予有柄石韦水提物，将药物敷于伤口上，并予清洁纱布包扎，每天给药1次，连续给药5 d。

1.2.2伤口缩小比例的计算造模当天设为第0天，于造模后第1、3、7、14及18天在伤口同一水平放置钢尺以作为伤口实际面积大小的参照物，数码相机拍摄。计算并记录伤口缩小比例[如：]第n～(n+3)天伤口缩小比例=(第n天伤口面积-第n+3天伤口面积)/第n天伤口面积×100%〗。

1.2.3病理组织染色造模后第3、7及18天时取小鼠伤口及创缘皮肤组织，于10%中性甲醛固定24 h，常规脱水，二甲苯透明和包埋组织块。5 μm切片，常规HE染色，光学显微镜下观察组织病理HE染色切片，以愈合区域再生表皮完整程度，肉芽组织紧致程度和出现水肿为指标判断伤口愈合质量，愈合质量较差为再生表皮不完整，肉芽组织松散，有水肿；愈合质量一般为再生表皮部分完整，肉芽组织无明显水肿；愈合质量较好为再生表皮完整，肉芽组织紧致，无水肿[5]。

1.3统计方法

2结果

2.1伤口缩小比例

云南白药组和有柄石韦组在第1～3天、第3～7天、第7～14天和第14～18天时段的伤口缩小比例均大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。而云南白药组在第1～3天、第3～7天和第14～18天时段的伤口缩小比例高于有柄石韦组，差异有统计学意义(P<0.05)，第7～14天差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　3组皮肤全层切除伤小鼠伤口缩小比例±s)

与对照组相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05；与云南白药组相比，(3)P<0.01,(4)P<0.05

2.2炎症细胞数量、肉芽组织松紧程度和上皮化程度

造模后第3天，云南白药组和有柄石韦组的肉芽组织较规则且厚实(图1A～B)，而对照组的肉芽组织显得菲薄和不规则(图1C)。造模后第7天，云南白药组和有柄石韦组的肉芽组织继续生长，相比造模后第3天，厚度有所增加，并且较为紧凑，无水肿现象，并且两组成纤维细胞数量明显增高(图1D～E)。而对照组相对无明显变化(图1F)。造模后第18天，3组伤口均基本愈合，与对照组相比，云南白药组和有柄石韦组的愈合后组织在镜下显得更为紧致，无水肿现象；且云南白药组有柄石韦组已出现较多的毛囊和皮脂腺(图1G～H)，而对照组相对较少(图1I)。

注：A、B、C分别为第3天云南白药组、有柄石韦组和对照组(HE，×200)；D、E、F分别为第7天云南白药组、有柄石韦组和对照组(HE，×400)；G、H、I分别为第18天云南白药组、有柄石韦组和对照组(HE，×200)图1　3组皮肤全层切除伤小鼠皮肤肉芽组织Fig.1　The HE dyeing of skin granulation tissue in three groups

3讨论

皮肤创伤是一种常见的健康问题，发生率较高，如处理不当会引起皮肤感染溃烂，延期愈合，寻找一种快速促进皮肤伤口愈合的药物，是药物研发领域最古老，也是最重要的挑战之一。云南白药作为我国传统促愈良药，可以显著缩短伤口出血时间、凝血时间及凝血酶原时间，现已被广泛应用于治疗临床创伤出血、消化道出血等各种出血性疾病[6]。有柄石韦是水龙骨科石韦属下的蕨类植物，产于中国东北、华北、西北、西南和长江中下游各省区，具有重要的药用价值，性甘、苦，微寒，归肺、膀胱经，有利尿通淋、清热止血的作用。《苗药》中被叫做黛口掌、锐猫棍，全草被用于治疗肺癌、膀胱癌、肾炎、膀胱炎、肾结石、血尿、咳血、衄血以及哮喘。石韦属植物主要成分为黄酮类化合物，如山奈酚槲皮素、异槲皮素、异槲皮苷、芒果苷类等。在贵州民间，多作为刀口药用于促进伤口愈合，且效果显著。因此对有柄石韦进行促进皮肤愈合研究，寻找其有效成分，为寻找皮肤创伤治疗药物提供了一个有效的研究途径。

本实验采用小鼠皮肤全层切除伤模型研究有柄石韦水提物对伤口愈合的作用。伤口愈合过程伴随肉芽组织增生及伤口面积缩小。肉芽组织中的成纤维细胞产生肌动蛋白，而形成肌成纤维细胞，这些细胞产生机械拉力，将创缘向中心牵拉，从而使伤口不断收缩，因此伤口缩小比例反映了伤口愈合的速度；同一段时间内伤口缩小比例越大，说明伤口愈合的趋势越明显。本研究结果显示，经云南白药和有柄石韦治疗的伤口缩小比例均大于同期的对照伤口，说明有柄石韦在促进伤口愈合上有积极作用。

上皮细胞、成纤维细胞在伤口修复过程中均有重要作用[7-8]。本研究采用HE染色评估创缘肉芽组织的生长情况，结果发现，云南白药组和有柄石韦组的肉芽组织较对照的肉茅组织紧致、厚实。云南白药组和有柄石韦组第18天的切片相对对照的上皮化完整，皮下已有毛囊和皮脂腺。证明有柄石韦提取物对伤口的愈合较为完全，附件功能恢复较好，与文献报道一致[9-11]。本研究后续将考虑提取有柄石韦活性物质及进一步探明和阐述。

4参考文献

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[4] 李雁群，黎桦，陈超君，等.石韦醇提物抑菌活性的初步研究[J].时珍国医国药， 2010(1) : 142 -143.

[5] 连泽勤，高健，李晓滨，等.白花檵木促大鼠皮肤伤口愈合物质基础初步研究[J].中国中药杂志， 2013(38)：3566-3570.

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[7] Barrientos, Stojadinovic O, Golinko MS, et al. Growth factors and cytokines in wound healing[J].Wound healing and Regeneration, 2008(5):585-601.

[8] 毛竹君，齐方洲，熊耀康，等.多枝柽柳乙酸乙酯提取物对小鼠皮肤伤口愈合的影响[J].浙江中医药大学学报， 2013(10):1222-1225.

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[10]孙晓明,张余光.缓释材料在促进皮肤伤口愈合中的应用研究及进展[J].中国美容整形外科杂志， 2013(2):119-121.

[11]杨虎，郑丽君，黄新建，等.壳聚糖护肤液促进大鼠伤口愈合的研究[J].中华皮肤科杂志, 2011(12):891-893.

(2016-01-03收稿，2016-04-20修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Effect of Promoting Healing ofPyrrosiapetiolosaWater Extract in Mice's Full-thickness Excision Wound

KONG Xiangyao, YU Shibo, LI Xiaomei, TANG Yi, NI Wen, CHEN Mingcui, ZHANG Jinjuan

(LaboratoryofChemistryandBiochemistry,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the effect of water extract of Pyrrosia petiolosa on mice's full-thickness excision wound. Methods: 75 Kunming mice received adaptive feeding for 3 days, and 100 mm2 full thickness skin resection model was established on mice's dorsal midline. Then the mice were randomly divided into blank control group, Yunnan baiyao group and Pyrrosia petiolosa group. In Yunnan baiyao group, the powder was applied to the wound while in Pyrrosia petiolosa group the water extract of Pyrrosia petiolosa applied to the wound, and both groups received continuous administration for 5 days, once per day. Wound's area and volume reduction ratio was calculated during 1～3 days, during 3～7 days, during 7～14 days and during 14～18 days, respectively. Mice were sacrificed 3th, 7th, 18thday after model establishment, HE dyeing was conducted for dorsal skin tissue. The growth of skin granulation tissue and the degree of re-epithelialization of wound skin in mice were observed in the three groups. Results: Compared with blank control group, the wound's area and volume reduction ratio in Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group during 1～3 days, 3～7 days, 7～14 days and 14～18 days was significantly higher(P<0.05). Compared with Pyrrosia petiolosa group, the wound's area and volume reduction ratio in Yunnan Baiyao group during 1～3 days, 3～7 days, and 14～18 days was significantly higher(P<0.05). On the 7thday, the thickness of granulation tissue increased, skin granulation tissue was more compact. Besides, no edema existed in skin granulation tissue and the number of fibroblasts was significantly increased. On the 18thday, wound almost healed in all three groups, but the tissue after wound healing in Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group was more compact compared with blank control group. Also, there was no edema in tissue of Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group. Conclusion: Pyrrosia petiolosa can promote wound healing but its effect is poorer thanYunnan Baiyao.

[Key words]Yunnan Baiyao; wound healing; skin granulation tissue; mice; Pyrrosia petiolosa

*[基金项目]大学生创新创业基金重点项目(NO.201410660001)

[中图分类号]R285； R29

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0555-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.015

**通信作者 E-mail:826609585@qq.com

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2204.062.html