miRNA-125b在鼻咽癌中的表达及与顺铂化疗敏感性研究

龚轩民,孙永东

(1.四川医科大学中西医结合学院，四川泸州 646000；2.四川医科大学附属中医医院耳鼻喉科，四川泸州 646000)



miRNA-125b在鼻咽癌中的表达及与顺铂化疗敏感性研究

龚轩民1,孙永东2△

(1.四川医科大学中西医结合学院，四川泸州 646000；2.四川医科大学附属中医医院耳鼻喉科，四川泸州 646000)

[摘要]目的探讨微小RNA-125b(miRNA-125b)在鼻咽癌组织、血清中的表达及与顺铂化疗敏感性的相关性。方法收集34例临床确诊鼻咽癌完整病例资料及组织和血清标本，另取患者癌旁组织为组织对照，同时收集34例健康体检者血清标本为血清对照，运用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)法检测miRNA-125b在癌组织、癌旁组织、血清中的表达，并进行统计学分析。结果miRNA-125b在癌组织的表达显著低于癌旁组织(P=0.006)，在鼻咽癌患者血清中的表达显著低于健康体检者(P=0.000)；miRNA-125b在患者癌组织与血清中的表达无相关性(r=0.112，P=0.528)。miRNA-125b在癌组织中的表达与病理分型、T分期、N分期有关(P<0.05)，在患者血清中的表达仅与N分期相关(P<0.05)。miRNA-125b在癌组织中表达与顺铂化疗敏感性呈负性相关(P<0.05)，在患者血清中的表达与顺铂化疗敏感性无明显相关性(P>0.05)。结论miRNA-125b的低表达可能参与了鼻咽癌的发生、发展，对鼻咽癌诊断、分型、分级有一定意义，在癌组织中的表达水平可作为筛选顺铂化疗方案的指标之一。

[关键词]微RNA-125b;鼻咽肿瘤;顺铂;化学疗法；敏感性

鼻咽癌是鼻咽黏膜上皮肿瘤，恶性程度高，具有浸润性强、易远处转移等特征，是头颈部最为常见的恶性肿瘤。鼻咽癌对放、化疗敏感，化疗方案首选顺铂(DDP)+5-氟尿嘧啶(5-FU)[1]，但是临床治疗过程中存在部分患者对化疗耐药的现象，给最佳化疗方案的选择带来一定盲目性。鼻咽癌的发生被认为与微小RNA(microRNA，miRNA)表达失衡有关，有研究证实miRNA-144在鼻咽癌组织中高表达[2]，miRNA-204在鼻咽癌组织中低表达[3]，这些现象可能会促进鼻咽癌侵袭和转移。miRNA-125b表达异常可能与肿瘤体积、侵袭、转移相关[4]，并且miRNA-125b可能通过对靶基因调控来影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[5]。但是鼻咽癌患者miRNA-125b有无异常表达，目前还少见报道。本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)法检测鼻咽癌患者癌组织与血清miRNA-125b的表达，初步探讨miRNA-125b与鼻咽癌发病的关系，以及对顺铂化疗敏感性的影响。

1资料与方法

1.1一般资料选取四川医科大学附属中医医院2012～2014年34例鼻咽癌患者为观察组，其中男29例，女5例，年龄34～67岁，中位年龄54岁。在患者化疗前收集癌组织、血清标本。同时取患者癌旁组织(距肿瘤边缘大于3 cm，经病理证实为正常黏膜组织)，选择同期健康体检者34例血清为对照组。纳入标准：(1)全部病例均经电子鼻咽镜取得组织活检，经病理确诊为原发性鼻咽癌；(2)具备完整的临床诊断、治疗资料；(3)均经过DDP化疗，3个疗程或以上，具备化疗效果比较；(4)患者无严重心、肝、肾、肺等全身性疾病，家属及患者知晓本研究过程、目的、意义，并同意参与。主要试剂与仪器：总RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京艾德莱生物)，血清RNA提取试剂盒(Applied Biosyste，美国)，引物设计与合成(上海生物工程公司)，ABI-7300定量荧光PCR仪(ABI公司，美国)。

1.2方法氯仿提取法提取组织总RNA，mirVana miRNA Isolation试剂盒提取血清总RNA，以分光光度仪检测260/280吸光度(OD)值。cDNA合成：取1 μg总RNA于20 μL反应体系为4.00 μL 5×RT缓冲液，0.75 μL 10 mmol/L dNTP，2.00 μL 25 mmol /L Mg2+，0.25 μL 40 U/μL RNA酶抑制剂，0.20 μL 200 U/μL逆转录酶，其余以dd H2O补足，反应条件为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min。real-time-qPCR：以U6为内参检测目的基因相对表达量，U6、miRNA-125b引物序列见表1，反应总体积为20 μL为2×miRNA qPCR Mix(含Sybr Green) 10 μL、反向引物0.4 μL、正向引物0.4 μL、cDNA产物1.0 μL、其余用dd H2O补齐，反应条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，共40个循环;所有反应设立3个复孔。得到Ct值，Ct值代表荧光达到阈值的循环数。

表1　引物序列

1.3顺铂化疗敏感性判定采用国际抗癌联盟实体肿瘤客观疗效标准。完全缓解(CR)：肿瘤完全消失，持续1个月以上；部分缓解(PR)：病灶最大横径与最大垂直径乘积缩小50%以上，持续1个月以上；疾病稳定(SD)：病灶两径乘积缩小不足50%，增大不超过 25%，持续1个月；进展(PD)：病灶两径乘积增大25%以上或有新病灶出现。高敏感组为CR+PR，低敏感组为SD+PD。

1.4统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料采用中位数及四分位数(P25～P75)表示，配对样本中目的基因miRNA-125b相对表达量采用2-△Ct，△Ct=CtmiRNA-125b-Ct U6，表示目的基因相对于内参基因表达量，独立样本中miRNA-125b的相对表达量2-△△Ct[6]，△△Ct=△Ct观察组-△Ct对照组，表示观察组相对于对照组目的基因表达量；癌组织与癌旁组织、患者血清与对照组血清miRNA-125b表达量比较采用秩和检验，癌组织、血清miRNA-125b相对表达量与临床指标、顺铂化疗敏感性关系，采用Mann Whitney U检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组miRNA-125b表达比较观察组患者癌组织中miRNA-125b表达量2-△Ct为7.62(4.26～13.91)，癌旁组织表达量2-△Ct为10.38(6.53～17.27)，差异有统计学意义(Z=-2.744，P=0.006)。观察组患者血清中miRNA-125b表达量2-△Ct为5.64(2.78～8.49)，对照组血清miRNA-125b表达量2-△Ct为9.16(6.34～14.05)，差异有统计学意义(Z=-3.992，P=0.000)。见图1。

图1　各组miRNA-125b相对表达量的比较

2.2观察组患者癌组织与血清miRNA-125b表达相关性分析癌组织miRNA-125b相对表达量2-△△Ct为0.685(0.436～0.825)，血清miRNA-125b相对表达量2-△△Ct为0.569(0.407～0.705)。鼻咽癌患者癌组织与血清miRNA-125b表达不存在相关性(r=0.112，P=0.528),见图2。

图2　观察组癌组织、血清miRNA-125b表达的相关性

2.3鼻咽癌患者miRNA-125b表达水平与临床指标间的关系根据鼻咽癌患者性别、年龄、病理分型、T分期、N分期进行分组，分析癌组织、血清miRNA-125b表达与临床指标的关系。结果显示鼻咽癌组织miRNA-125b相对表达量2-△△Ct与性别、年龄无关，N+较N-分期表达显著降低(P=0.000)；在病理分型的比较中，低、未分化型明显低于中、高分化型(P=0.027)；T3～4期明显低于T1～2期(P=0.016)。血清miRNA-125b相对表达量2-△△C与性别、年龄、T分期、病理分型无关，仅与淋巴结转移相关(N+表达量明显低于N-，P=0.031)，见表2。

2.4鼻咽癌患者miRNA-125b表达与顺铂化疗敏感性关系化疗高敏感组鼻咽癌组织miRNA-125b相对表达量2-△△Ct为0.712(0.569～0.847)，低敏感组为0.558(0.418～0.705)，差异有统计学意义(Z=-2.572，P=0.010)。化疗高敏感组血清miRNA-125b相对表达量2-△△Ct为0.553(0.403～0.746)，低敏感组为0.571(0.401～0.712)，差异无统计学意义(Z=-0.782，P=0.429)，见表3、图3。

表2　鼻咽癌患者癌组织、血清miRNA-125b的表达与临床指标间的关系(n=34)

表3　鼻咽癌患者miRNA-125b表达与顺铂化疗敏感性的关系

A:癌组织；B:血清。

图3鼻咽癌患者miRNA-125b表达与顺铂化疗敏感性的关系

3讨论

miRNA是一类进化保守的单链非编码RNA，长度为20～22个核苷酸。miRNA可以通过与靶mRNA的3′非翻译区结合，抑制其翻译或者导致序列特异性靶mRNA降解，从而使基因沉默来发挥调节细胞增殖、凋亡、分化的生物学活性[7]。随着人类基因图谱的完善，通过生物信息学分析发现，仅仅占人类基因组不到3%的miRNA可能参与了30%左右的人类基因调控[8]，超过50%的miRNA位于肿瘤相关基因区域内。研究证实在人类多种恶性肿瘤组织中出现miRNA异常表达的现象[4,9]，提示某些miRNA可能作为癌基因或者抑癌基因在恶性肿瘤的发生过程中扮演核心角色。鼻咽癌的发病机制非常复杂，EB病毒感染被认为是重要原因之一，但新近研究发现和miRNA表达失衡也有密切联系[2]。Sengupta等[10]揭示了鼻咽癌组织miRNA 表达谱，发现miRNA-29c、miRNA-212等8个miRNA 有较明显的表达改变。miRNA-144、miRNA-204表达异常也被认为与鼻咽癌发病有关[2-3]。提示miRNA在鼻咽癌发生、发展过程中可能发挥了重要作用。miRNA-125b是miRNA家族较为活跃的成员，可能对肿瘤发生起着调控作用，与分化、增殖、侵袭、转移等诸多肿瘤细胞生物学活性相关[4,11-12]。据报道，miRNA-125b作为抑癌基因表达于肺癌[4]、肝癌[11]等癌组织中，作为癌基因表达于前列腺癌、胰腺癌[12]等癌组织中。但是在鼻咽癌组织中有无表达异常，还少见报道。本研究采用real time-qPCR分析鼻咽癌组织和癌旁组织miRNA-125b表达量，发现癌组织miRNA-125b较癌旁组织表达明显降低(P=0.006)。提示miRNA-125b可能作为抑癌基因存在于鼻黏膜组织，其表达降低可能使得相关癌基因激活，从而参与到鼻咽癌的发生。

外周循环血miRNA稳定性高，不易被降解。研究显示，循环血miRNA对肿瘤早期诊断、分期、预后有一定预见作用[13]。熊伟明[14]通过miRNA芯片筛选鼻咽癌患者外周血清中表达异常的miRNA，发现有miRNA-296、miRNA-361等76个较健康志愿者高表达，miRNA-125b、miRNA-487b等104个较低表达。但是此研究仅进行了miRNA-125b的筛选，并没有进行验证检测。本研究通过检测血清中miRNA-125b水平发现，与健康体检者比较，鼻咽癌患者miRNA-125b表达明显降低(P=0.000)，与癌组织的检测结果相符合。但二者表达并无相关性，可能是由于样本量较少，缺乏大样本量的比对数据所致。

本研究进一步分析了miRNA-125b表达与临床指标间的关系。鼻咽癌组织中miRNA-125b表达与淋巴结转移、病理分型、T分期显著相关(P<0.05)。在血清中，miRNA-125b表达与淋巴结转移相关(P<0.05)。提示miRNA-125b可能参与了鼻咽癌的发展、转移、侵袭。表明miRNA-125b作为抑癌基因与肿瘤细胞生物学活性、肿瘤进程密切相关[15-16]。联合检测鼻咽癌组织和血清miRNA-125b表达可能对临床分期、分级有一定帮助。

miRNA-125b可以通过对Bap1、Bbc3、Neu1、Bcl2、Stard13等靶基因的调控来影响肿瘤细胞对化学治疗药物耐药[5]。Duroux-Richard等[17]发现在血清中miRNA-125b水平可以作为抗肿瘤药物利妥昔单抗使用的生物学指标。本研究结果显示，对顺铂低敏感组患者鼻咽癌组织miRNA-125b表达要低于高敏感组(P=0.010)，而血清中表达无差异。表明在未使用化疗药物时癌组织miRNA-125b表达与顺铂化疗敏感性呈一定负相关。但是据Chen等[18]的最新报道，采用顺铂治疗的鼻咽癌患者miRNA-125b表达量会增加，反而降低了化疗敏感性。但本研究分析的检测指标均来自未进行化疗的患者，二者研究对象有差异。同时这也说明鼻咽癌涉及miRNA-125b对顺铂耐药的机制十分复杂，需要进一步探索，尤其是在分子水平对上下游通路进行研究。

综上所述，miRNA-125b可能作为抑癌基因在鼻咽癌的发生、发展过程中起到重要作用，其表达变化可以反映鼻咽癌分型、淋巴结转移、临床分期等肿瘤进展程度。miRNA-125b有望成为鼻咽癌患者顺铂化疗的筛选指标，为化疗方案选择提供依据。但是本研究依然存在样本量少、缺乏相关分子机制研究作为支撑的局限，后续应该加强和相关研究机构的合作，进行大样本量实验进一步探索miRNA-125b和鼻咽癌的关系，为鼻咽癌的诊断、治疗提供新思路。

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Study on expression of miRNA-125b in nasopharyngeal carcinoma and sensitivity of cisplatin chemotherapy

Gong Xuanmin1,Sun Yongdong2△

(1.College of Traditional Chinese and Western Medicine，Sichuan Medical University,Luzhou, Sichuan 646000,China;2.Department of Otolaryngology,Affiliated Hospital of TraditionalChinese Medicine,Sichuan Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the whether miR-125b expression having the abnormality in nasopharyngeal carcinoma tissues and serum and whether having the correlation with the sensitivity of cisplatin chemotherapy.MethodsThe intact medical records and tissue and serum samples in 34 cases of clinically diagnosed nasopharyngeal carcinoma were collected and the serum samples in 34 individuals undergoing the physical examination were also collected as the controls.The expression of miRNA-125b in carcinoma tissue,paracancerous tissue and serum was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time qPCR).The statistical analysis was performed.ResultsThe expression of miRNA-125b in carcinoma tissue was significantly lower than that in paracancerous tissue(P=0.006),and serum miRNA-125b expression in nasopharyngeal carcinoma patients was significantly lower than that in the individuals undergoing the healthy physical examination(P=0.000);but the miRNA-125b expression had no correlation between the paracancerous tissue and serum(r=0.112，P=0.528).The expression of miRNA-125b in cancer tissues was correlated with the pathological typing,T staging and N staging(P<0.05),the serum miRNA-125b expression in carcinoma subjects was only related with the N staging (P<0.05).The expression of miRNA-125b in carcinoma tissue was negatively correlated with the sensitivity of cisplatin chemotherapy (P<0.05),however,there was no obvious correlation between the serum miRNA-125b level and the sensitivity of cisplatin chemotherapy (P>0.05).ConclusionThe low miRNA-125b expression may be involved in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma and plays a certain significance for the diagnosis,pathology typing and classification of nasopharyngeal carcinoma.Its expression level in cancer tissue can serve as one of indicators for screening out the cisplatin chemotherapy sche

[Key words]microRNA-125b;nasopharyngeal neoplasms;cisplatin；chemotherapy;sensitivity

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.022

作者简介：龚轩民(1986-)，住院医师，在读硕士，主要从事鼻咽癌发病机制和中西医结合治疗的研究。△通讯作者，E-mail:sunyongd@126.com。

[中图分类号]R739.63

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)11-1515-04

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-02-06)