美托洛尔对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制研究*

李　强，陈海燕，胡厚祥△，徐继前，谭春燕，徐　磊,张　双，王　欢，张荣驿，岳荣川，罗　涛

(1.川北医学院附属医院心内科，四川南充 637000；2.重庆市南川区人民医院心内科　408400)



美托洛尔对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制研究*

李强1,2，陈海燕1，胡厚祥1△，徐继前1，谭春燕1，徐磊1,张双1，王欢1，张荣驿1，岳荣川1，罗涛1

(1.川北医学院附属医院心内科，四川南充 637000；2.重庆市南川区人民医院心内科408400)

[摘要]目的探讨美托洛尔对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制。方法取健康3～4个月雄性C57BL/6小鼠32只，分为4组(n=8)，即对照组、美托洛尔组、缺血再灌注组(I/R组)和美托洛尔+缺血再灌注组(美托洛尔+I/R组)。检测各组小鼠心肌损伤情况、心肌细胞凋亡率、细胞色素c(Cyt C)的释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性及钙蛋白酶(calpain)活性。结果与I/R组相比，美托洛尔预处理后，显著减少了心肌梗死区与缺血危险区域的比率(P<0.05)，而心肌缺血危险区域与左心室的比率并无明显变化；与对照组相比，I/R组心肌细胞凋亡率、心肌组织Cyt C的释放、Caspase-3活性及calpain活性均明显增高(P<0.01)，美托洛尔预处理能抑制I/R损伤引起的上述变化。结论美托洛尔可能通过抑制心肌细胞内calpain的活化，从而抑制心肌细胞凋亡，最终减轻心肌的I/R损伤。

[关键词]心肌；心肌缺血；心肌再灌注；美托洛尔；钙蛋白酶；细胞凋亡

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是因冠状动脉阻塞后心肌细胞死亡引起的，是人类心血管疾病的主要死亡原因。迅速恢复正常的血液供应是减少心肌损伤唯一有效的方法。然而，再灌注本身也可引起心肌的损伤和心脏功能的紊乱，称之为“再灌注损伤”(reperfusion injury)[1]。因此，减轻心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是一种治疗缺血性心脏病的重要手段。

美托洛尔是一种β-受体阻滞剂，大量实验表明，β-受体阻滞剂可以减少心肌梗死面积，减少室颤的发生，改善心室重构，从而保护心脏功能[2-3]。最近研究表明，美托洛尔可以减轻心肌I/R损伤[4]，但其具体机制仍有待进一步阐明。本研究采用结扎/松解小鼠左冠状动脉前降支(LAD)的方法建立心肌I/R模型，美托洛尔预处理后，通过检测小鼠心肌损伤情况、心肌细胞凋亡率、细胞色素c(Cyt C)的释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性及钙蛋白酶(calpain)活性，以探讨美托洛尔减轻心肌I/R损伤的可能机制。

1材料与方法

1.1材料清洁级3～4个月雄性C57BL/6小鼠(由第三军医大学实验动物中心提供)，饲养于温度和湿度可控制的设施中，给予正常饮水和饮食，正常光照(光照∶黑暗=12 h∶12 h)。所有的实验操作均符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》，实验方案得到第三军医大学实验动物伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1实验分组取健康3～4个月雄性C57BL/6小鼠32只，分为4组(n=8)。(1)对照组：每日给予1 mL 0.9% NaCl(NS)空腹灌胃1次，连续3 d后行假手术，麻醉开胸后，只穿线，不结扎血管。(2)美托洛尔组：按对照组的方法，NS中含美托洛尔缓释片(10 mg/kg)。(3)缺血再灌注组(I/R组)：每日给予1 mL NS空腹灌胃1次，连续3 d后，结扎LAD，缺血45 min后，再灌注3 h。(4)美托洛尔+缺血再灌注组(metoprolol+I/R组)：按I/R组的方法，NS为含美托洛尔的溶液(10 mg/kg)。

1.2.2心肌I/R损伤模型的建立实验小鼠以4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉后，胸前区去毛，仰卧固定于鼠台，行气管插管后连接小动物呼吸机维持通气。胸前区消毒，于心尖搏动处纵行逐层分离皮肤、肌层，挣开4～5肋骨，暴露心脏，剥离心包膜，并以8-0丝线在距离左心耳下缘2 mm左右处穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针，在结扎LAD时连同一50号聚乙烯管(polyethlene tubing 50,PE 50)一同结扎，行缺血实验。给予4 mm H2O正压通气，挤出胸腔内空气后关闭胸腔。在缺血45 min后，重新打开胸腔，移除PE 50管，恢复再灌注3 h。假手术组以相同方式手术，但不做结扎。

1.2.3心肌梗死面积的测定心肌梗死面积的大小由梗死区域与危险区域质量的百分比表示。按照文献[5]方法测定心肌梗死面积。缺血45 min，再灌注3 h后打开胸腔，再次结扎LAD，自主动脉根部逆行注入1%伊文思蓝染液1 mL使相应冠状动脉所灌注的心肌着色(而结扎血管远端心肌即缺血危险区不着色)。处死小鼠，取出心脏，分离出左心室，从心尖起横向切成均匀等厚的4片薄片，置于1%的氯化三苯基四氮哇(TTC)磷酸缓冲液中，37 ℃常温孵育15 min。采用高分辨率解剖显微镜对每片心肌组织进行拍照。使用图像分析系统(Sigma ScanPro,Ashburn,VA)对每块染色区域进行定量分析。正常区域(蓝色)、危险区域(红色)和梗死区域(白色)的大小用总体积的质量百分比表示，心肌梗死范围的大小以梗死区质量除以缺血危险区的质量表示。

1.2.4Cyt C的测定胞质Cyt C的浓度用Quantikine小鼠Cyt C ELISA试剂盒(R&D Systems,Quantikine,USA)测定。取梗死区周围心肌组织，匀浆，离心(1 600 g,10 min，4 ℃)，收集上清液并测量蛋白浓度。加入酶标试剂后，将样本转移到微孔板中，加入抗Cyt C抗体，室温下孵育120 min，之后加入过氧化物酶底物试剂室温孵育10 min，用稀释好的HCl溶液终止反应，最后用酶标仪测量A450，做标准曲线计算出Cyt C的浓度。

1.2.5Caspase-3活性测定按照文献[6]方法用BIOMOL(Plymouth Meeting,PA)Caspase-3检测试剂盒AK-700来检测细胞Caspase-3的活性。取梗死区域周围心肌组织，匀浆，测量蛋白浓度。取200 μg样本，加入Caspase-3底物Ac-DEVD-AMC，加或不加抑制剂Ac-DEVD-CHO，37 ℃孵育4 h，用酶标仪测荧光强度(激发波360 nm，发射波460 nm)，Caspase-3的活性由μg每小时AMC的水解量来表示。

1.2.6calpain活性测定按照文献[7-8]方法，通过检测calpain的特异性荧光底物N-succinvl-LLVY-AMC(Cedarlane Laboratories)来测定细胞calpain的活性。称取梗死区域周围心肌组织，裂解，匀浆，取上清液并测定蛋白浓度。分别用含钙和无钙检测缓冲液将SUC-LLVY-AMC稀释，将稀释好的SUC-LLVY-AMC加入样本中，37 ℃孵育2 h，用酶标仪检测荧光强度(激发波380 nm，发射波460 nm)。calpain的活性用在含钙和无钙检测缓冲液中所测得的荧光强度差异来表示。

1.2.7细胞凋亡的检测采用TUNEL法标记凋亡细胞,按照文献[9]方法，使用原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche,Indianapolis,IN)来定位和定量检测心肌细胞的凋亡。取梗死区域周围心肌组织，用4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后切成5 μm厚的切片，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法，根据试剂盒说明行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。15个不同的梗死区域周围的心肌组织使用荧光显微镜在放大630倍的视野下计算TUNEL阳性核染色的细胞数，激光共聚焦显微镜下采集图片。在双盲的条件下计算出各组TUNEL阳性心肌细胞占总细胞数的百分比。

2结果

2.1美托洛尔减轻I/R引起的心肌损伤结扎LAD 45 min，再灌注3 h。美托洛尔+I/R组与I/R组相比，虽然心肌缺血危险区域与左心室的质量百分比并无明显变化，但其梗死区域与危险区域质量百分比明显减小(P<0.05)，见图1。

A：危险区域与左心室质量百分比；B：梗死区域与危险区域质量百分比。*：P<0.05，与I/R组比较。

图1美托洛尔对小鼠心肌I/R损伤的影响

2.2美托洛尔减少I/R引起的心肌细胞凋亡与对照组相比，I/R组TUNEL染色阳性细胞核比率显著增高，细胞凋亡率明显增高(P<0.01)，见图2。与对照组相比，美托洛尔+I/R组TUNEL染色细胞凋亡率明显增高(P<0.01)，但与I/R组相比，美托洛尔+I/R组TUNEL染色阳性细胞核比率显著降低(P<0.05)。

A：心肌细胞TUNEL染色的代表性图片；B：各组心肌细胞TUNEL染色阳性细胞核比率统计图。*：P<0.01，与对照组比较；†：P<0.05，与I/R组比较。

图2美托洛尔对小鼠心肌I/R细胞凋亡的影响

2.3美托洛尔能抑制Cyt C释放如图3所示，与对照组相比，I/R组小鼠心肌梗死周围区域细胞质Cyt C水平显著升高(P<0.01)，经美托洛尔预处理后Cyt C水平显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.01)。

2.4Caspase-3活性及心肌细胞内calpain的活化与对照组相比，I/R组Caspase-3活性明显升高(P<0.01)，美托洛尔+I/R组则明显低于I/R组(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.01)，见图4A。经I/R处理后，小鼠心肌细胞内calpain活性显著增高(P<0.01)，美托洛尔预处理后明显抑制了calpain活性(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.01)，见图4B。

*：P<0.01，与对照组比较；†：P<0.05，与I/R组比较。

图3美托洛尔对Cyt C释放的影响

*：P<0.01，与对照组比较；†：P<0.05，与I/R组比较。

图4美托洛尔对Caspase-3活性(A)及calpain活性(B)的影响

3讨论

心血管疾病是人群死亡的主要原因，其中缺血性心脏病占很大的比例。缺血性心脏病是一种常见的具有高发病率和高病死率的临床综合征[10]。经皮冠状动脉介入治疗(PCI)和溶栓治疗能有效地减少心肌梗死面积和改善临床症状，但同时也会引起心肌的再灌注损伤及心脏功能紊乱，其潜在机制是很复杂的，目前研究主要集中于Ca2+超载、氧化应激、炎性反应及细胞凋亡[11]。另外，有研究表明，calpain在心肌I/R损伤、线粒体通透性转换及细胞凋亡中发挥重要作用[12]。过多的calpain活化在心肌I/R损伤的线粒体损伤和氧化磷酸化中起重要作用。此外，使用calpain抑制剂可抑制I/R损伤中凋亡诱导因子(AIF)及Caspase-3的释放，从而减少心肌梗死面积和细胞凋亡[13-14]。

美托洛尔是一种高选择性β1-受体拮抗剂，它广泛使用于AMI和心力衰竭的临床治疗及临床前应用。有研究表明，在家兔心力衰竭模型中，美托洛尔的应用可减轻心室重构、心脏肥大、氧化应激及心肌细胞凋亡[15]。该研究采用结扎/松解小鼠LAD的方法建立心肌I/R模型，证明美托洛尔能通过抑制Cyt C从线粒体向细胞质中释放及降低Caspase-3活性，从而减轻心肌I/R后细胞凋亡。同时，该研究发现美托洛尔能抑制心肌I/R引起的细胞内calpain活化。表明美托洛尔可能通过减少细胞内calpain的活化，抑制线粒体途径的细胞凋亡通路，减少心肌细胞凋亡，从而发挥对心肌I/R损伤的保护作用。

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Protective effect of metoprolol on ischemia-reperfusion induced myocardial tissue injury in mice*

LiQiang1,2，ChenHaiyan1，HuHouxiang1△，XuJiqian1，TanChunyan1，XuLei1，ZhangShuang1，WangHuan1，ZhangRongyi1，YueRongchuan1，LuoTao1

(1.DepartmentofCardiology，AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong,Sichuan637000，China；2.DepartmentofCardiology，thePeople′sHospitalofNanchuan，Chongqing408400，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the possible mechanism of metoprolol on protecting against ischemia-reperfusion induced injury.MethodsA total of 32 healthy 3-4 months male C57BL/6 mice were divided into four groups(n=8)as following：Sham-operating group(control group);metoprolol group;ischemia-reperfusion group(I/R group);metoprolol + I/R group.Myocardial injury,apoptosis,cytochrome c release,Caspase-3 activity and calpain activity were determined in these groups.ResultsAlthough there was no obvious changes in the regions at risk between I/R group and metoprolol + I/R group,metoprolol pretreatment significantly reduced the ratio of the infarct to risk regions(P<0.05).In the I/R group,the rate of cardiomyocyte apoptosis,cytochrome c release,as well as the activity of Caspase-3 and calpain significantly increased compared to the control group(P<0.01).However,these effects of I/R injury were alleviated by pretreatment with metoprolol.Conclusionmetoprolol might protect against ischemia-reperfusion induced injury by preventing calpain activation.

[Key words]myocardium；myocardial ischemia；myocardial reperfusion；metoprolol；calpain；apoptosis

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.009

*基金项目：国家自然科学基金项目(81070101)；四川省教育厅课题(12ZA060)。

作者简介：李强(1971-)，副主任医师，本科，主要从事心血管内科工作。△通讯作者，E-mail：hhxiang17@163.com。

[中图分类号]R541.4

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)03-0317-03

(收稿日期：2015-08-06修回日期：2015-10-31)