腹膜透析液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达的影响

伍　军，何　敏，张　健，何文飞，程　兵

(汕头大学医学院附属粤北医院肾内科，广东韶关 512026)

腹膜透析液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达的影响

伍军，何敏，张健，何文飞，程兵

(汕头大学医学院附属粤北医院肾内科，广东韶关 512026)

[摘要]目的观察不同浓度葡萄糖(dextrose)腹膜透析液、艾考糊精(icodextrin)腹膜透析液对人腹膜间皮细胞Toll样受体2(TLR2)和TLR4表达的影响。方法体外培养人腹膜间皮细胞株第5～10代(HMrSV5，DMEM/F12培养基含10%胎牛血清)用于实验研究。MTT检测细胞活力，实验分为5组：阴性对照组、1.50% dextrose组、2.50% dextrose组、4.25% dextrose组、7.5% icodextrin组，应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TLR2和TLR4的表达水平。结果不同浓度dextrose腹膜透析液作用24 h对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4的表达无明显影响。作用48 h，1.50% dextrose组、2.50% dextrose组、4.25% dextrose组TLR2分别降低(5.5±2.8)%、(31.4±7.5)%、(54.9±1.9)%，TLR4分别降低(32.9±17.6)%、(47.7±13.5)%、(66.4±13.5)%；作用72 h，1.50% dextrose组、2.50% dextrose组、4.25% dextrose组 TLR2表达分别降低(29.4±14.7)%、(38.9±9.9)%、(63.5±16.5)%，TLR4表达分别降低(59.5±16.8)%、(63.1±9.5)%、(79.2±14.0)%；7.5% icodextrin组TLR2和TLR4表达与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论dextrose透析液下调HMrSV5 TLR2和TLR4的表达；icodextrin透析液对TLR2和TLR4的表达无显著影响。

[关键词]腹膜透析；人腹膜间皮细胞；Toll样受体2；Toll样受体4

传统含葡萄糖(dextrose)腹膜透析液(简称“腹透液”)使用乳酸盐作为标准缓冲液(pH 5.2～5.5)，dextrose作为渗透剂。大量研究已经证实，乳酸盐dextrose腹透液的低pH值和高渗透性可抑制白细胞、腹膜间皮细胞、腹腔巨噬细胞和成纤维细胞的功能，长期暴露于生物不相容的腹透液被认为是影响宿主对感染的抵抗及对腹膜结构和功能产生负面影响的因素之一，而宿主对感染的抵抗能力下降是影响腹膜炎发生率和严重程度的重要危险因素[1-4]。Toll样受体(TLR)是机体天然免疫防御机制的重要组成部分，其中，TLR2主要识别革兰阳性细菌细胞壁成分，TLR4主要识别革兰阴性细菌细胞壁成分，在防御细菌感染中发挥重要作用。配体结合TLR2和TLR4可诱导激活共同的下游信号通路包括NF-κB、MAPK(ERK、p38、JNK)及IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的分泌[5]。那么，dextrose腹透液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4的表达有无影响？此外，作为新型腹膜透析液，艾考糊精(icodextrin)腹透液是否影响TLR2和TLR4的表达？目前尚无相关报道。本研究拟在体外水平观察不同浓度dextrose腹透液、icodextrin腹透液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达的影响。

1材料与方法

1.1材料与试剂细胞：人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)购自ATCC公司。主要试剂：不同浓度dextrose腹透液(1.50% dextrose,2.50% dextrose,4.25% dextrose)，icodextrin腹透液(7.5% icodextrin)由中国广州百特医疗有限公司提供。四甲基-偶氮唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]购自美国Sigma公司。兔抗人TLR2多克隆抗体、兔抗人TLR4单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1不同种类腹膜透析液对HMrSV5细胞活力的影响HMrSV5细胞株的体外培养、传代，将细胞按1×104/mL(200 μL)接种于96孔培养板，同步化培养24 h。实验分为5组：阴性对照组(加同体积培养基)、1.50% dextrose组、2.50% dextrose组、4.25% dextrose组、7.5% icodextrin组，不同种类腹膜透析液作用细胞24、48、72 h，无细胞接种孔为空白对照；作用时间结束，加入20 μL MTT(5 mg/mL)于37 ℃，5% CO2培养4 h，吸弃培养孔液体，加入二甲基亚砜(DMSO)150～200 μL置摇床上低速振荡10～15 min，使结晶物充分溶解，连续光谱光密度读板仪490 nm处测量各孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率=(腹透液刺激组-空白对照组)/(阴性对照组-空白对照组)×100%。

1.2.2不同种类腹透液对HMrSV5细胞TLR2和TLR4表达的影响HMrSV5细胞株按上述分组方法同步化培养24 h，各组受试因素分别作用24、48、72 h后收集细胞，提取总蛋白，蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TLR2和TLR4的表达。

2结果

2.1不同种类腹透液对HMrSV5细胞活力的影响1.50% dextrose组、4.25% dextrose组、7.5% icodextrin组腹透液作用24 h各组细胞存活率分别为(98.4±3.9)%、(99.4±7.3)%、(72.0±16.2)%、(98.1±6.2)%；腹透液作用48 h各组细胞存活率分别为(94.4±11.4)%、(92.7±9.20%、(71.2±7.0)%、(94.8±8.1)%；腹透液作用72 h各组细胞存活率分别为(73.4±3.9)%、(79.3±9.4)%、(60.5±5.4)%、(79.5±7.1)%，见图1。

1：阴性对照组；2：1.50% dextrose组；3：2.50% dextrose组；4：4.25% dextrose组；5：7.5% icodextrin组。

图1不同种类腹膜透析液对HMrSV5细胞活力的影响

2.2不同种类腹透液对HMrSV5细胞TLR2和TLR4表达的影响与阴性对照组比较，各腹透液作用24 h各透析液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达无显著影响，见图2。腹膜透析液作用48 h后1.5%dextrose组、2.5%dextrose组、4.25%dextrose组TLR2表达分别降低(5.5±2.8)%、(31.4±7.5)%(P<0.05)、(54.9±1.9)%(P<0.05)，与阴性对照组比较，后两组差异有统计学意义；TLR4表达分别降低(32.9±17.6)%(P<0.01)、(47.7±13.5)%(P<0.01)、(66.4±13.5)%(P<0.01)，与阴性对照组比较差异有统计学意义。7.5% icodextrin组TLR2和TLR4表达分别下降(4.4±4.5)%和(8.9±8.6)%，与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。与阴性对照组比较，腹透液作用72 h后1.5%dextrose组、2.5%dextrose组、4.25% dextrose组TLR2表达分别降低(29.4±14.7)%(P<0.05)、(38.9±9.9)%(P<0.05)、(63.5±16.5)%(P<0.05)，与阴性对照组比较差异有统计学意义；TLR4表达分别降低(59.5±16.8)%(P<0.01)、(63.1±9.5)%(P<0.01)、(79.2±14.0)%(P<0.01)，与阴性对照组比较差异有统计学意义；7.5% icodextrin组TLR2和TLR4表达分别下降(5.3±3.3)%和(1.2±11.9)%，与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

1：阴性对照组;2：1.50% dextrose组；3：2.50% dextrose组；4：4.25%dextrose组；5：7.5% icodextrin组。

图2不同种类腹透液作用24 h对HMrSV5细胞TLR2和TLR4表达的影响

1：阴性对照组;2：1.50% dextrose组；3：2.50% dextrose组；4：4.25%dextrose组；5：7.5% icodextrin组；a:P<0.05，b:P<0.01,与阴性对照组比较。

图3不同种类腹透液作用48 h对HMrSV5细胞TLR2和TLR4表达的影响

1：阴性对照组;2：1.50% dextrose组；3：2.50% dextrose组；4：4.25%dextrose组；5：7.5% icodextrin组；a:P<0.05，b:P<0.01,与阴性对照组比较。

图4不同种类腹透液作用72 h对HMrSV5细胞TLR2和TLR4表达的影响

3讨论

TLR是Ⅰ型跨膜蛋白受体，其特征是胞外区存在富含亮氨酸的重复序列，胞内区约有200个氨基酸与白细胞介素-1(IL-1),Ⅰ型受体和IL-18受体有高度同源性，称为Toll/IL-1受体同源区(TIR)，共同构成TLR向下游进行信号传递并最终激活NF-κB p65的核心元件。髓样分化因子88(MyD88)是与TIR作用的关键衔接蛋白，其招募IL-1受体相关激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，激活NF-κB和MAPK信号，最终启动一系列靶基因的转录。其中，TLR2主要识别革兰阳性细菌胞壁成分，TLR4主要识别革兰阴性细菌胞壁成分，同时还介导吞噬和自噬防御病原微生物、抗原提呈等，从而在防御病原微生物感染中发挥重要作用[6-9]。早期研究已证实腹膜间皮细胞表达TLR4及其附属功能蛋白，腹膜间皮细胞TLR4在细菌内毒素诱导趋化因子、炎症因子中发挥关键作用，有可能成为腹腔细菌感染的重要干预靶点[10]。

本研究发现，dextrose腹透液显著下调腹膜间皮细胞TLR2和TLR4的表达，作者推测TLR2和TLR4表达下降可能导致腹膜间皮细胞对病原微生物识别、抗原提呈、下游信号转导等功能下降，进而导致腹腔局部免疫防御功能降低。国外学者研究发现，他汀类药物下调外周血CD14+单核细胞TLR4的表达，下调TLR4的功能结果是TLR4配体LPS诱导的IRAK-1激酶活性下降，LPS诱导的TNF-α、IL-12和B7-1表达降低[11]。维生素D3下调外周血单核细胞TLR2和TLR4的表达，维生素D3预处理的单核细胞对LTA(脂胞壁酸，TLR2配体)和LPS刺激的反应降低，表现为配体诱导的ERK1/2、p38 MAPK及NF-κB信号减弱，进而下游TNF-α表达下降[12]。研究显示阿托伐他汀下调单核细胞白血病细胞(THP-1)TLR4的表达，NF-κB活性减弱，LPS诱导的TNF-α、IL-6、IL-1β表达下降[13]。国内学者研究发现，黄芪多糖下调心肌细胞TLR4表达，NF-κB活性减弱，LPS诱导的TNF-α的表达下降[14]；全氟化碳下调肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)TLR4表达，NF-κB活性减弱[15]。本研究结果与这些报道类似，进一步的dextrose腹透液对TLR2和TLR4下游信号分子的研究正在进行中。

icodextrin腹透液含7.5%多聚dextrose，是谷物淀粉的水解产物，相对分子质量为16 800～22 000，渗透浓度为284 mmol/L，低于1.50% dextrose组的346 mmol/L、2.50% dextrose组的396 mmol/L、4.25% dextrose组的485 mmol/L。因其相对分子质量较大、不易透过腹膜吸收，故能在较长时间内持续发挥超滤作用，且其生物相容性优于dextrose腹透液[16-17]。本研究发现，icodextrin腹透液对间皮细胞TLR2和TLR4的表达无明显影响，提示icodextrin可能不影响TLR介导的腹腔局部免疫防御机制，进一步的icodextrin腹透液对TLR2和TLR4下游信号分子的研究正在进行中。作者推测，上述机制可能是icodextrin腹透液的生物相容性优于dextrose腹透液的机制之一。

综上所述，dextrose腹透液下调腹膜间皮细胞TLR2和TLR4的表达，icodextrin腹透液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4的表达无显著影响，本研究从新的角度证实传统dextrose腹透液的长期使用有可能降低腹腔局部防御能力。

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Effect of peritoneal dialysis fluids on the expression of TLR2 and TLR4 on peritoneal mesothelial cells*

WuJun,HeMin,ZhangJian,HeWenfei,ChengBin

(DepartmentofNephrology,theAffiliatedYuebeiHospitalofMedicalColledgeofShantouUniversity，Shaoguan,Guangdong512026,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of glucose-based peritoneal dialysis fluids and icodextrin-based peritoneal dialysis fluids on the expression of TLR2 and TLR4 on huamn peritoneal mesothelial cells.MethodsHuman peritoneal mesothelial cell line 5-10 generations(HMrSV5) was cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum (FCS).Cell viability and cell proliferation were assessed using MTT method.The experiment were divided into 5 different groups:group A (control group),1.5%dextrose group,2.5% dextrose group,4.25% dextrose group and 7.5% Lcodextrin group.Icodextrin group (aikau dextrin),TLR2 and TLR4 expression were detected by Western blot.ResultsTreatment with different concentrations of glucose-based peritoneal dialysis fluids for 24 h did not affect the expression of TLR2 and TLR4 protein.In addition,after stimulation for 48 h,1.5%dextrose,2.5%dextrose,4.25% dextrose decreased TLR2 expression by(5.5±2.8)%,(31.4±7.5)%,(54.9±1.9)% respectively,TLR4 expression by (32.9±17.6)%,(47.7±13.5)%,(66.4±13.5)% respectively.Stimulation for 72 h,decreased TLR2 expression by (29.4±14.7)%,(38.9±9.9)%,(63.5±16.5)% respectively,TLR4 expression by(59.5±16.8)%,(63.1±9.5)%,(79.2±14.0)% respectively.There was no significant change in TLR2 and TLR4 protein expression on 7.5% icodextrin group.ConclusionGlucose-based peritoneal dialysis fluids,but not icodextrin-based peritoneal dialysis fluids downregulates expression of TLR2 and TLR4 by HMrSV5.

[Key words]peritoneal dialysis；human peritoneal mesothelial cells；Toll-like recepter 2；Toll-like recepter 4

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.004

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81200555)。

作者简介：伍军(1979-)，副主任医师，博士，主要从事腹膜透析的基础与临床研究。

[中图分类号]R459.5

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)02-0156-03

(收稿日期：2015-09-18修回日期：2015-10-14)