HPLC法测定不同产地淫羊藿药材中两种黄酮类化合物的含量

郑秀茜，房　城，刘永武，贾博宇（黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）



HPLC法测定不同产地淫羊藿药材中两种黄酮类化合物的含量

郑秀茜，房城，刘永武，贾博宇
（黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

摘要：目的：建立HPLC法测定不同产地淫羊藿药材中淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι成分含量的方法。方法：色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18柱，流动相为乙腈-水梯度洗脱，检测波长为270nm，流速为1.0mL·min-1。结果：淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι成分的线性关系良好，线性范围分别为0.800～45.00，0.550～24.90mg·L-1；加样回收率分别为96.85%、98.16%，RSD分别为0.45%、1.28%（n=6）。结论：该方法准确、简便、重复性好。淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι为淫羊藿药材中特征性成分，可作为指标性成分用于淫羊藿药材的质量控制。

关键词：HPLC；淫羊藿；淫羊藿苷；淫羊藿属苷Ⅰ

淫羊藿（Epimediumbrevicornu Maxim）为小檗科植物的干燥叶。三出复叶，先端微尖，叶片近革质。气微，味微苦。具有补肾阳，强筋骨，祛风湿等作用。用于肾阳虚衰，阳痿遗精等症［1］。主产于四川，甘肃，宁夏，东北等地。该药材中黄酮含量最高［2］，是其主要作用成分。2015年版《中国药典》中以淫羊藿苷的含量作为该药材质量鉴别的指标性成分，其要求淫羊藿苷不得少于0.50%.然而市售药材中淫羊藿苷基本不符合药典要求。因此，应对淫羊藿进行多方面考察，检测淫羊藿苷的同时，应增加成分测定作为淫羊藿药材质量控制的新指标。本文通过对50批主要产地、不同批次的淫羊藿中淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι的含量情况进行分析测定，可以为淫羊藿药材质量评价提供重要的科学依据。

1　实验部分

1.1仪器与试药

Aglient 1290高效液相色谱工作站；Aglient 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；FA2004型分析天平（上海良平仪器有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

淫羊藿苷与epimedokoreanoside I均来自实验室自制，通过核磁共振谱鉴定结构，采用面积归一化法计算出化合物纯度大于98.56%。色谱级乙腈、甲醇（天津市康科德科技有限公司，批号：141008）；娃哈哈纯净水；分析纯乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。50批来自国内不同产地的淫羊藿药材。

1.2色谱条件和系统适用性

色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18柱（5 μm，250mm ×4.6mm，）；DAD检测波长：270nm；进样体积：5μL；体积流量：1.0mL·min-1；柱温：25±0.15℃；流动相系统如下表所示A：乙腈；B：水。理论塔板数按淫羊藿苷峰计不低于10000，相邻两色谱峰之间的分离度应不小于1.5，拖尾因子应大于0.95，并且小于1.05。

表1　流动相系统Tab.1 Gradient elution program for HPLC

1.3溶液的制备

1.3.1对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι适量，加甲醇溶解制成对照品溶液，质量浓度分别为0.401、0.508g·L-1的对照品溶液。

1.3.2样品溶液的制备将药材粉碎，过三号筛，于分析天平精密称取粉末0.2g，倒入具塞三角瓶中，加入稀乙醇20mL称重，经超声1.5h后，补足超声过程中损失的重量，摇匀提取液，经0.25μm的微孔滤膜滤过，取续滤液。

2　结果与讨论

2.1线性范围考察

按1.2项下色谱条件，由低浓度到高浓度顺序对两种对照品溶液进行分析，测定得到峰面积。得到线性回归方程，见表2。

表2　线性回归方程Tab.2 Results of regression equation

以上结果表明：淫羊藿苷、epimedokoreanoside I在如表所示的范围呈现良好的线性关系。

2.2精密度考察

任取一份淫羊藿药材，制备成供试品溶液按1.2项下色谱条件、2.1.2项下制备方法，进样6次，测定淫羊藿苷的色谱峰面积，其RSD值为0.25%，小于3.0%，该结果表明实验所用仪器及方法具有良好的精密度，符合要求。

2.3稳定性考察

任取一份淫羊藿药材，制备成供试品溶液按1.2项下色谱条件，1.3项下制备方法，分别在第0、2、4、8、12、24h进样分析，测定出淫羊藿苷的峰面积，计算峰面积的RSD值为0.46%，测定结果证实供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.4重复性考察

按1.2项下色谱条件、1.3项下制备方法，取淫羊藿药材，制备6份相同样品供试品溶液，测定出化合物淫羊藿苷的峰面积，峰面积的RSD值为0.37%，表明本实验方法具有良好的重复性。

2.5加样回收率实验

按1.2项下色谱条件、1.3项下制备方法，取6份已知含量的淫羊藿药材，每份0.1g于具塞锥形瓶中。向每组中分别加对照品混合溶液，进样分析。回收率结果如表3所示。

表3　加样回收率Tab.3 Results of recoveries test（n=6）

2.4含量测定实验

本实验同时测定了来自4个地区分别为四川、甘肃、宁夏、东北等地的淫羊藿药材中淫羊藿苷及Epimedokoreanoside I的含量，进行对比。供试品溶液按样品溶液配制方法制备，按1.2条件测定，用外标一点法得出含量，见表4。

3　结论

淫羊藿中淫羊藿苷的含量差异较大，大部分药材低于药典标准。50批次药材中受产地、种系、时间影响，因环境等因素均不相同，是造成淫羊藿药材质量差异的主要原因。

本文对50批不同产地药材中淫羊藿苷及Epimedokoreanoside I进行了含量测定，其中Epimedokoreanoside I测定结果在0.11%～0.01%范围内，初步拟定药材中Epimedokoreanoside I的含量不低于0.01%，可与淫羊藿苷同作为淫羊藿药材质量控制的指标。测定多种黄酮类成分指标用于淫羊藿的质量标评价体系，将epimedokoreanoside Ι作为药材质量控制的指标之一，用以评价药材质量。

表4　50批药材中淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι的含量测定结果Tab.4 Contents of Icariin and Epimedokoreanoside Ι in 50samples（%）

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京:中国医药科技出版社,2015.327.

［2］蒋俊,崔丽等.基于淫羊藿黄酮类化合物的体内代谢阐述其抗骨质疏松药效物质基础［J］.中草药，2014，45（5）:721-729.

［3］孟宁,孔凯,李师翁.淫羊藿属植物化学成分及药理活性研究进展［J］.西北植物学报,2010,30（5）:1063-1073.

Simultaneous determination of 2 flavonoids in Epimedium by HPLC

ZHENG Xiu-xi，FANG Cheng，LIU Yong-wu，JIA Bo-yu
（Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract：Objective: To develop a method for the quantitative analysis of icariin, epimedokoreanoside I，totally 2 flavonoids in Epimedium. Methods: The analysis was performed by using a Zorbax SB-C18analytical column （250mm×4.6mm, 5μm）at gradient elution of acetonitrile and water with diode-array detection（270nm）, the flow rate was 1.0mL·min-1. Results: All calibration curves showed good linearity within test ranges. The recoveries were 96.85%、98.16%and the RSD f were0.45%、1.28%（n=6）. Conclusions: This method is reliable, simple and reproducible. It can be used for the determination method of Epimedium. icariin, epimedokoreanoside I was indeed the specific ingredient in epimedium herbs, the method able and sensitive for quality control of Epimedium herbs, and can be used as indicators of the quality control Epimedium medicinal ingredients.

Key words:HPLC；Epimedium；icariin，epimedokoreanoside I

中图分类号：R28

文献标志码：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160533

收稿日期：2016-03-28

作者简介：郑秀茜（1987-），女，黑龙江省哈尔滨市，硕士，研究实习员。

通讯作者：贾博宇（1977-），女，博士，副研究员，研究方向：中药抗衰老、抗肿瘤的药效学研究。