核素锝[99mTc]对维甲酸诱导骨髓间充质干细胞的干预研究

李　玮



核素锝[99mTc]对维甲酸诱导骨髓间充质干细胞的干预研究

李玮

摘要：目的研究核素锝[99mTc]对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的影响。方法采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，以30 μmol·L-1维甲酸诱导其向神经元样细胞分化，并测定核素锝[99mTc]干预骨髓间充质干细胞分化后的生物学影响。结果活度为740、1 110 MBq·mL-1锝[99mTc]干预骨髓间充质干细胞6 h后，细胞存活率分别为(96.03±2.21)%、(94.47±2.12)%，锝[99mTc]干预的骨髓间充质干细胞在维甲酸诱导下可表达神经元的特异性标记物Nestin和NSE。结论常规剂量下锝[99mTc]不影响骨髓间充质干细胞的细胞活力和分化。

关键词：99mTc；骨髓间充质干细胞；神经前体细胞；神经元

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)的主要功能是参与构成造血干细胞生存和分化的微环境。近年发现它还具有向多种细胞系转化的潜能[1]，可以诱导分化为神经样细胞[2]、心肌样细胞[3]及多种结缔组织细胞(纤维、骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪细胞等)[4]，并且自体获取的骨髓间充质干细胞回输后不会发生免疫排斥反应，体外基因转染率高，因此骨髓间充质干细胞已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点[5]。但骨髓中骨髓间充质干细胞的含量非常少，大约每10万个单个核细胞中只含有1个骨髓间充质干细胞[6]。因此，需在体外分离纯化、培养扩增后，才能满足临床服务要求。

核素锝[99mTc]具有适宜的半衰期，具有极佳的射线成像品质，被广泛应用于临床核医学显像[7]，通过其所标记的亚甲基二膦酸盐(methylene diphosphonate,MDP)与骨骼吸附应用于全身骨成像。但锝[99mTc]对其内骨髓间充质干细胞的影响目前还缺乏了解。本研究探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞的细胞活性、分化等生物学特性的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂6～8周龄的SD大鼠(雌雄不限)，体质量120 g左右，由河南省实验动物中心提供。高糖DMEM/F12(美国Gibco公司)，全反式维甲酸、胰蛋白酶为Sigma公司产品，多聚赖氨酸、GFPA、NSE、Nestin免疫组化试剂盒(streptavidin-perosidase，SP)为北京中山生物技术有限公司产品，台盼兰为Chroma公司产品。

1.2实验方法

1.2.1MSCs的分离纯化取SD大鼠，引颈处死，75%乙醇浸泡5～10 min，无菌条件下将大鼠双下肢剪下，转移置于超净工作台上，分离股骨和胫骨。剪去股骨胫骨的两端,充分暴露骨髓腔，注射器吸取5 mL10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，取冲洗液，梯度密度离心3次，弃上清，用培养基重悬。1×105·mL-1接种细胞于培养瓶中，37 ℃、pH 7.2条件下培养于5% CO2培养箱。48 h可见细胞黏附贴壁，每周换液两次，待细胞贴壁率大于90%时，0.5 mL复合消化酶消化，于镜下密切观察细胞形态。按1∶2传代，重复上述操作，反复传代为P2～P6。

1.2.2诱导分化和免疫组化染色取P4～6代细胞，以(4～5)×106·mL-1密度接种于24孔板，待细胞80%融合，用含30 μmol·L-1维甲酸、20 μg·L-1bFGF、10%FBS的DMEM/F12培养基诱导骨髓间充质干细胞为实验组；对照组不加诱导剂。对骨髓间充质干细胞诱导前、诱导后8 d、13 d的神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学染色鉴定。

1.2.3锝[99mTc]对MSCs的诱导①锝[99mTc]干预MSCs细胞活力的测定：选取P4～6代骨髓间充质干细胞，无锝[99mTc]培养基为对照组，实验组放入含锝[99mTc]配制培养基，按活度分为740、1 110、1 480、2 960 MBq·mL-14组，细胞密度(4～5)×106·mL-1。细胞培养12 h均更换为正常培养基，8 d及13 d时分别进行MTT法检测细胞活力。每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，继续孵育4 h后弃上清，加入100 μL DMSO终止反应。微震荡，酶标仪波长490 nm处测得吸光度值(A)。空白对照组细胞存活率记为100%，实验组细胞存活率(%)=(实验组A值/空白对照组A值)×100%。②锝[99mTc]干预MSCs诱导分化的免疫组化染色：锝[99mTc]干预骨髓间充质干细胞时，得到MTT法证实细胞活力无影响的放射性比活度(740 MBq·mL-1)。以此对原代培养骨髓间充质干细胞进行干预，并在30 μmol·L-1维甲酸诱导前、诱导后8 d、13 d时，对骨髓间充质干细胞Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定，计算Nestin、NSE、GFAP染色阳性的细胞数比例。

2结果

2.1MSCs的培养原代培养72 h，贴壁细胞分裂增殖，细胞团细胞不断分裂增殖，新生的细胞圆形，位于中心，周围的细胞逐渐变为梭形。5 d后可见集落形成，1周后集落增多，互相融合，细胞逐渐变成梭形。多次传代的MSCs达融合生长时，有更均匀有序的成纤维细胞样分布，见图1A。

2.2神经元样细胞的诱导分化和免疫组化全反式维甲酸诱导4 d后，大部分细胞发生形态改变：较多细胞形态呈神经元样改变，可见明显神经元样的细胞突起，相邻细胞间相互联结成网状；7 d后大部分细胞呈神经元样形态。对照组形态未发生明显改变。诱导前、诱导8 d和13 d后的细胞进行NSE、Nestin、GAFP免疫细胞化学鉴定，DAB染色显示胞质呈棕黄色为阳性表达细胞。发现神经元样细胞特异性标记物Nestin和NSE染色呈阳性(见图1B、C)，胶质细胞特异性标志GAFP为阴性，对照组染色均为阴性。

2.3锝[99mTc]干预MSCs细胞活力的测定与对照组相比较，锝[99mTc]浓度为740、1 110 MBq·mL-1组的细胞活力在各时间点均无明显变化(P>0.05)；当锝[99mTc]浓度升高至1 480、2 960 MBq·mL-1时，两组细胞活力明显降低(均P<0.05)。见表1。

表1　不同浓度锝[99mTc]干预MSCs存活率　%

2.4锝[99mTc]干预MSCs分化的免疫组化740 MBq·mL-锝[99mTc]干预维甲酸诱导MSCs定向分化为神经元的能力，诱导前、诱导8 d和13 d后的NSE、Nestin、GAFP免疫细胞化学鉴定，DAB染色显示胞质呈棕黄色为阳性表达细胞，发现神经元样细胞的Nestin和NSE染色呈阳性(见图1D、E)，GAFP为阴性。NSE表达呈逐渐上调，Nestin表达下降，对照组染色均为阴性(见表2)。

A：骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样改变(×400)；B：骨髓间充质干细胞维甲酸诱导后Nestin阳性(SP，×400)；C：骨髓间充质干细胞维甲酸诱导后NSE阳性(SP，×400)；D：锝[99mTc]对骨髓间充质干细胞在维甲酸诱导后NSE染色(SP，×200)；E：锝[99mTc]对骨髓间充质干细胞在维甲酸诱导后Nestin染色(SP，×200)。图1　锝[99mTc]对MSCS诱导的影响

%

3讨论

骨髓MSCs在骨髓中的含量极少，大约10～100 MSCs/1×106BMCs左右[8]。目前对于骨髓中MSCs的分离比较常用的方法是密度梯度离心法[9]、贴壁细胞分离法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。作为组织工程的种子细胞，细胞的纯度越高越好。密度梯度离心法操作较贴细胞分离法稍复杂，但细胞纯度较后者高，更符合组织工程研究的要求。作者通过密度梯度离心法和贴壁细胞分离法分离得到大鼠骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞经几次传代后，细胞变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样，通过此方法培养的MSCs在第一代时纯度达90%，第二代超过95%。

[99mTc]是核素显像中目前临床应用最广泛的显像核素，70%～80%用于标记亚甲基二膦酸盐为全身骨显像。但其对骨髓中富集的干细胞特别是骨髓间充质干细胞的辐射能造成什么样的后果，目前还不清楚，国内也缺乏相关的研究。本实验应用锝[99mTc]对骨髓间充质干细胞存活和分化的影响做了研究，实验中未发现正常检查剂量(740～1 110 MBq·mL-1)对骨髓间充质干细胞有明显影响。在放射性活度>1 110 MBq·mL-1时，可引起骨髓间充质干细胞的活性降低。在随后的试验中，作者用安全剂量(740 MBq·mL-1)的锝[99mTc]干预维甲酸诱导的MSCs向神经元样细胞分化，8 d、13 d后发现细胞可以定向分化为神经元样细胞，可表达神经前体细胞和神经元的特异性标记物Nestin和NSE，但分化能力总体上有所降低。

实验证实，被锝[99mTc]干预的骨髓间充质干细胞仍具有正常生长及多向分化的能力，其毒性和剂量大小的关系不明显。这项研究为临床上指导核医学常规工作以确保受检者的安全性及核医学医务工作者和核医学工作相关人员的个人防护管理等提供了基础研究支持。

参考文献：

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[2]辛颖,李玉林,张丽红.成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞[J]中国实验诊断学,2007,11(1):4-7.

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作者单位：河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003

Intervention Study of Retinoic Acid Induced Bone Mesenchymal Stem Cell Differentiated into Neuron with Nuclide Technetium[99mTc]

LI Wei

(First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impact of [99mTc] to bone mesenchymal stem cells (MSCs) induced by retinoic acid to differentiate into neuron-like cell.MethodsMSCs were isolated and purified by density gradient centrifugation and adherent culture, and then induced into neuron-like cell by 30 μmol·L-1retinoic acid. Biologcial effects of neuron-like cell were determined after [99mTc] interfered in the differentiation of MSCs.ResultsAfter the interference of 740、1 110 MBq·mL-1[99mTc] for 6 hours, cell survival rate was(96.03±2.21)% and (94.47±2.12)%respectively,and Nestin and NSE were expressed in the progress of 740 MBq·mL-1[99mTc] interfering in the differentiation of MSCs. ConclusionThe cell viability and differentiation of MSCs were not affected by the conventional dose of [99mTc] in vitro.

Key words:99mTc；bone mesenchymal stem cell；nerve precursor cell；neuron

文章编号：1672-688X(2016)02-0084-03

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.002

中图分类号：R445.5;R818.03

文献标志码：A

收稿日期：2016-02-22

作者简介：李玮(1974-)，男，河南洛阳人，医师，从事核医学诊断治疗工作。