纯化PCR产物检出微量生物检材STR分型1例

刘亚举，张俊涛



纯化PCR产物检出微量生物检材STR分型1例

STR Genotype of a Trace Biological Sample by Purified PCR Products

刘亚举1，张俊涛2

关键词：法医遗传学；微量DNA；纯化PCR产物；竞争性电泳

2.襄城县公安局刑侦大队，河南襄城 461700

随着DNA检验方法的成熟，大量的微量DNA被检出，当微量生物检材得到的模板DNA量有限时，PCR扩增产物的再利用就显得尤为重要，因为另辟蹊径能够拓展DNA技术在法庭科学中的应用领域，促进DNA技术的深度应用。

1案例资料

1.1简要案情某年12月，侦破系列抢劫杀人案，在团伙人员居住地提取1.5 m光滑木棍1根，木棍上检出死者李某(10月底被杀害)DNA，但团伙成员拒不承认使用过该凶器，将木棍进行犯罪行为人的DNA检验。

1.2检验情况及结果

用移液器吸取20 μL浅黄色的纳米银溶液滴到4N6FLOQSwabsTM植绒拭子(AB公司，美国)顶端部，使之半湿润，擦拭木棍受力部位[1]，擦拭时来回拭抹、旋转拭子表面，将检材放入1.5 mL的离心管中，加入Prep-n-GoTM缓冲液(AB公司，美国)25 μL，以离心半径9.5 cm、10 000 r·min-1、离心10 s，然后在室温中静置10 min，最后参照磁珠法[2]提取基因组DNA。按Identifiler Plus试剂盒(AB公司，美国)说明书配制PCR反应液，采用12.5 μL扩增体系，模板DNA为1、2、4 μL，在9700型扩增仪上分28和30个循环进行复合扩增。

按照MinElute®PCR Purification kit(QIAGEN公司，德国)在QIAcube工作站上的操作手册进行。首先布置QIAcube工作界面，将PCR产物10 μL加入2 mL离心管中，放到QIAcube加热震荡模块1～6处；在试剂槽A-C的位置旁边依次放上1 000、200 μL 的Disposable Filter-Tips；将试剂盒中的MinElute硅胶膜离心柱和新的1.5 mL离心管分别放于Rotor Adaptor 1和3处；在缓冲液槽1、5、6处依照操作手册放置Buffer PB、Buffer PE(每次使用时添加24 mL无水乙醇)和Buffer EB。然后启动Forensic post-PCR purification protocol程序，其中“Edit”状态下“Fill-up volume”输入90 μL即可，洗脱体积选择15 μL。最后在Rotor Adaptor 3处的1.5 mL离心管中得到纯化后的PCR产物溶液15 μL。

取2 μL纯化后的PCR产物与0.25 μL内标Liz-500和10 μL去离子甲酰胺混合，95 ℃变性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遗传分析仪上按标准进样条件(24 s、1.2 kV进样、15 kV电泳)全自动毛细管电泳，用GeneMapper ID-X软件进行STR分型。

本例检材磁珠法DNA提取，采用2 μL模板DNA进行28个循环数扩增，其PCR产物纯化后，经电泳检测与分型，检出完整STR分型，结果见图1-2。此DNA结果与4号犯罪行为人的DNA一致，从而认定了行凶者。

2讨论

在本案中，需要对凶器上的脱落细胞进行DNA检验，微量生物检材想要得到完整STR分型，应从以下方面改善：DNA提取方法、PCR扩增(增加循环数)、毛细管电泳检测(提高进样电压和延长进样时间、PCR产物脱盐处理)。文献[3]比较了28个循环数的PCR产物脱盐处理、改善毛细管电泳检测电压和时间、34个循环数的PCR扩增在痕量法医检材上的应用，结论是28个循环数的PCR产物脱盐处理优于其他方法。由于微量生物检材得到的模板DNA量有限，因此充分利用PCR扩增产物显得尤为重要，PCR产物脱盐处理主要有凝胶、过滤、纯化等。本文借鉴方法[4]纯化PCR产物，按标准条件(24 s、1.2 kV进样、15 kV电泳)进样和毛细管电泳，得到了完整STR分型。

A：D7S820等位基因丢失;B：D2S1338等位基因丢失;C：D18S51等位基因峰值低;D：D5S818和FGA等位基因未检出

图1PCR产物纯化前的STR分型

A：D7S820等位基因未丢失;B：D2S1338等位基因未丢失;C：D18S51等位基因峰值均衡;D：D5S818和FGA等位基因检出

图2PCR产物纯化后的STR分型

本例DNA检验，MinElute®PCR Purification kit在QIAcube上进行PCR产物纯化主要有“结合、洗涤、洗脱”3个步骤。适量的缓冲液PB携带的PCR产物溶液结合到MinElute硅胶膜时，是在高离液盐和pH≤7.5环境中进行，此时硅胶膜结合PCR产物才最大化，同时缓冲液PB又是经特殊设计优化，不

仅可以去除盐离子，还能有效去除<40 bp的DNA及<40 nt的单链DNA，从而降低检测中引物峰的干扰；当PCR产物结合到硅胶膜上后，洗涤缓冲液PE可将盐离子、dNTP、引物、残留酶、降解产物等杂质透膜，残余的PE又会通过离心作用被除去；缓冲液EB将PCR产物从MinElute硅胶膜洗脱时，在低离液盐环境中进行，且pH在7.0～8.5之间才能最佳，一定量的缓冲液EB提供了合适的盐离子浓度和最佳的pH值，并且对后续反应无抑制效果。PCR产物纯化之前，在恒定的电压下和一定的进样时间内，DNA同时要和内标及PCR产物的其他组分竞争性进入毛细管，如果DNA被电泳检测的量少，就会影响到STR分型成功率；脱盐纯化后的PCR产物，纯度更高，进入毛细管的扩增产物就增多，电泳检测的STR峰型强度也高，大大地降低了背景干扰，使结果判读清晰可见。另外，在不提高随机阈值的情况下，扩增产物的电泳上样量，本文分别采用1、2、4、5 μL进行梯度检测，最终2 μL的上样量较为理想，随着量的增加，会出现非特异性的峰增高。

本例DNA检验，使用该工作站对PCR产物进行了自动纯化操作，其最主要的特点就是避免了手工操作影响干预pH值，因pH值是决定获得成功STR分型的至关重要因素，所以能够满足日常工作需要。

参考文献：

[1]刘亚举,孙现锋,徐超,等.生物脱落细胞提取仪联合EZ-tape胶带侦破命案1例[J].法医学杂志，2012,28(3):235.

[2]刘亚举,苏伟民.食物残渣STR分型破案1例[J].中国司法鉴定,2013,(4):121-123.

[3]Luke Forster JT,Stefan Kutranov.Direct comparison of post-28-cycle PCR purification and modified capillary electrophoresis methods with the 34-cycle “low copy number” (LCN) method for analysis of trace forensic DNA samples[J].Forensic Sci Int(Genetics),2008,2(4):318-328.

[4]Smith PJ,Ballantyne J.Simplified low-copy-number DNA analysis by post-PCR purification[J].J Forensic Sci,2007,52(4): 820-829.

作者单位：1.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌 461000

文章编号：1672-688X(2016)02-0141-02

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.022

中图分类号：DF795.2

文献标志码：B

收稿日期：2015-10-09

作者简介：刘亚举(1978-)，男，河南襄城人，副主任法医师，从事DNA检验及法医遗传学统计工作。