测定端粒长度推断法医学年龄的研究进展

杨吉庆，黄兆样，梁　杰，夏志远，翟仙敦，莫耀南



测定端粒长度推断法医学年龄的研究进展

杨吉庆1，黄兆样2，梁杰3，夏志远4，翟仙敦4，莫耀南4

摘要：目的对不同组织细胞端粒长度与法医学年龄关系的研究进行综述，为相关研究提供参考。方法参考近年来有关文献，对端粒的结构及功能、端粒长度的测定方法、不同组织细胞端粒长度与法医学年龄的关系，以及端粒长度的影响因素等方面进行系统回顾。结果不同组织细胞端粒长度与法医学年龄关系显著。结论测定端粒长度对于法医学年龄推断具有重要意义。

关键词：法医学；年龄推断；端粒

2.海南省保亭县公安局, 海南保亭572300

3.海南省五指山市公安局，海南五指山 572200

4.河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003

法医学个体识别中，准确的年龄资料可以为刑事案件的侦破提供重要的信息。目前通过骨龄检测尚可对个体法医学年龄进行大致推断，然而利用现场遗留下的软组织碎块、各种斑痕等生物性检材进行法医学年龄推断，目前仍然没有一套成熟可靠的方法。端粒是存在于各种组织细胞内，由染色体末端重复序列和结合蛋白组成的帽状结构，随着个体年龄的增加，端粒长度也会随之缩短，因此利用现场生物检材端粒长度推断法医学年龄是一种方法。本文对有关文献加以综述，重点回顾端粒结构、端粒长度的测量方法、端粒长度与年龄的关系、端粒长度改变的影响因素等内容，为利用端粒长度推断法医学年龄的相关研究提供思路。

1端粒研究概述

1.1端粒的结构和功能

端粒是由位于染色体末端的重复序列和结合蛋白组成。目前发现，序列的重复单位在不同物种之间并不完全相同，例如最早发现的重复单位是位于四膜虫端粒上的CCCCAA六碱基序列，而后来发现人和其他哺乳动物的端粒重复单位则是TTAGGG[1]。而有些生物体，如草履虫，其端粒是以由TTGGGG和TTTGGG共同组成，而酵母菌端粒则是由TG、TGG和TGGG组成。但由于大多数端粒的重复单位都含有3个或3个以上的G，所以含有3个或3个以上G的这条单链也称作多G链(stand G enriched，G-rich strand)，并由其构成端粒3’末端。人类端粒为双链结构，并且在3’末端，多G链比互补链长，而突出这段多G链通过氢键作用将链中每4个G固定在同一平面内，形成G-四连体结构(G-quadruplexes)。这一结构对DNA的复制和端粒的延长有阻碍作用[2]。而端粒整体经过卷曲、回环形成端粒环(telomere loops,T-loops)，从而将染色体尾端隔离；而端粒环最尾端单链DNA结构嵌入端粒双链DNA中形成一段三链结构，这一结构命名为置换环(displacement loop,D-loop)[3]。因此，端粒的这种结构对维持染色体结构的稳定、防止染色体端与端的融合起着重要作用。

端粒的作用还依赖于端粒结合蛋白的参与。端粒结合蛋白(shelterin telomeric binding protein)即6个蛋白的复合体，由TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1和POT1组成。端粒结合蛋白的主要功能为抑制染色体末端DNA损坏应答机制的激活和控制端粒酶对染色体末端的作用。具体来说，TRF1对端粒DNA片段具有特异识别功能，限制端粒酶对端粒的延长作用[4]；TRF2对于稳定多G链结构，防止端粒融化具有重要作用；RAP1可以调节NF-κβ介导通路[5]；TIN2具有抑制TRF1多聚ADP核糖基化作用[6]；TPP1具有吸引端粒酶的作用[7]；而PTO1在端粒酶活性的抑制剂或激活剂，阻止端粒融合，抑制DNA修复系统功能等方面具有重要作用[8]。

端粒功能异常时，染色体末端之间会发生融合，从而激活“断裂-融合-桥接”循环(B/F/B circle)，直至染色体得到新的端粒。目前发现在着丝粒和染色体末端靠近末端也发现有重复序列[9]，这种序列被称为间质端粒序列(interstitial telomeric sequences，ITSs) ，可能与端粒融合和染色体易位有关。

1.2端粒长度的影响因素

端粒长度受很多因素影响，大致可以分为社会心理因素、行为习惯因素、环境因素、肿瘤和疾病因素以及其他因素。有研究表明，短时间暴露于污染的环境中，可以使白细胞端粒长度增加，而长期暴露于污染的环境中，则使白细胞端粒缩短。前者认为端粒长度增加与短时间的炎症反应有关，而后者端粒长度缩短与长期的氧化应激有关[10]。也有实验将酵母菌暴露于不同的生长环境中，其中高温和咖啡因等刺激能使酵母菌端粒变短，乙醇等刺激能使其端粒变长[11]。也有研究表明激光(gamma=632.8 nm,P=2 mW)可以减慢端粒变短速度[12]。而坚持高有氧运动可以延缓端粒长度的缩短速度[13]。肿瘤细胞由于端粒酶的活性被激活，所以其端粒可维持在一定的长度而不发生变化[14]。越来越多的疾病被报道与端粒长度有关，如先天性角化不良、特发性肺纤维化、再生障碍性贫血、冠状动脉疾病、心衰等[15-16]。

1.3端粒长度的测量方法

国内外测量端粒的长度的方法主要有Southern Blot、PCR、荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridisation,FISH)以及在此基础上改进的方法如单端粒长度分析(single telomere length analysis, STELA)、实时定量PCR(Q-PCR)、单染色体多通路实时定量PCR(monochrome multiplex Q-PCR，MMQPCR)、定量荧光原位杂交(quantitative fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)以及流式细胞荧光原位杂交(Flow-FISH)等。其中，Southern Blot为第一代端粒测量技术，适合于130左右的样本量，常常被作为评定新方法优劣的标准。而Q-PCR是唯一可以实现高通量的技术，适合于大样本量的研究，如对流行病学的研究、新药物的筛选等。Flow-FISH可同时分析多种血细胞，适合于20～50样本量。Q-FISH可以进行单细胞端粒长度的测量，适合5～10的样本量。MMQPCR可以进行单染色体端粒长度的测量。STELA可以进行单个端粒长度的测量，适合1～5的样本量。

不同方法优缺点比较具体如下：Q-PCR是目前唯一可实现高通量的技术，适合大样本的研究；缺点为结果准确性相对较低，不适合精密测量。MMQPCR是基于Q-PCR的一个新版本，可在不同拷贝数下对多组DNA模板进行研究，如对细胞mtDNA、rDNA、Alu DNA拷贝数目的研究[17]；Southern Blot为端粒长度测量的第一代技术，常作为评判新测量技术的标准。缺点是DNA需要总量大，需要来自105个以上细胞的基因组，对于非常短的端粒相对不敏感，所得结果为所有染色体端粒的平均长度，并非某个染色体端粒的长度[18]。Flow-FISH可准确测量单个细胞的平均端粒长度，并可用于多种细胞端粒长度的测量，目前为端粒长度提供了最广泛的数据参考资料，并且是第一个利用端粒长度参与临床诊断的技术；缺点为难以确定未知细胞清洗条件；为了保护细胞表面抗原，只能选择同种固定液的新鲜血液样品[19]。STELA最大的优点为可以在pg数量级或50个细胞左右提供可靠的端粒长度结果，所以适用于稀罕类型细胞端粒长度测量；缺点为单个染色体端粒长度不能代表整个细胞端粒长度水平，而且仅限于于XpYp, 2p, 11q, 12q 和17p的检测；而且对于较长端粒检测能力有限，一般上限为20 kb[20-22]。

2端粒长度与法医学年龄的关系

2.1端粒长度推断法学年龄的理论基础除大脑皮质、灰质、心肌细胞、生殖细胞外，人体几乎所有体细胞端粒长度会随时间的延长而缩短。假设某种体细胞端粒长度随时间均匀缩短，那么可以通过测量该细胞端粒初始长度和端粒年缩短速率来推算法医学年龄。有研究表明新生儿时的白细胞、脐动脉和包皮三者端粒长度是同步的，而正常大脑皮、髓质和心肌细胞端粒长度在个体一生变化不明显[23]。所以端粒初始长度可以用新生儿体细胞端粒长度或者脑皮、髓质或者心肌细胞端粒长度来代替。假设某种体细胞端粒长度随时间变化不均匀，呈现一定的时间阶段性，那么除了需要测量该种体细胞端粒初始长度，还需要测量该体细胞端粒的终止长度，而终止长度可以用百岁老人相应体细胞长度来代替。在此基础上还需要测量不同时间阶段该细胞端粒长度的平均值。目前对端粒长度研究最多的国家是日本，其所得的大量实验数据表明，不同种类的体细胞端粒长度随时间呈阶段性变化趋势。在进行端粒长度的法医学年龄推断时，还需要考虑种族性别是否能带来的端粒长度的变异，有研究表明中国汉族和藏族外周血白细胞端粒长度变化并无差异，但性别之间存在阶段性差异，认为在0.1～14岁和65岁以上存在性别差异，其他年龄不存在明显差异[24]。

2.2法医常见检材的端粒长度变化规律法医学最常见尸体检材有心、肺、肝、脾、肾、胰、脑、胃肠、喉头气管、甲状腺、及肾上腺等。其中正常脑皮、灰质、心肌细胞端粒长度终身变化不明显，但对于有心肌肥大的心肌细胞端粒长度年缩短率为20 bp[25]。其他组织器官端粒长度随时间程序阶段性变化趋势，且所有端粒长度年缩短率在100 bp以下，以甲状腺和甲状旁腺年缩短率最大。部分组织器官端粒长度变化数据见表1。

表1　不同组织细胞端粒长度

3端粒长度在法医学应用展望

犯罪现场遗留的血迹、精斑、唾液、毛发、软组织等常见的法医物证，对于个体识别起着重要的作用，准确测量这类检材端粒的长度，对于犯罪嫌疑人的甄别、侦查范围的划分均具有重要意义。Tsuji[32]等人研究表明，只有现场环境下DNA能够很好保存，可以进行粗略年龄推断，年龄=-0.0095y+148.9±7.037(y：平均TRF长度)。也有研究表明[33]，冰冻融化和4 ℃保存4 d的血液，测得结果与直接静脉抽血后所测结果一致。但该方法测量干燥的血迹中的全血和单核细胞的端粒长度，发现两者结果明显高于指尖取血或直接静脉抽血所得结果。对于精子端粒长度的研究，目前认为年龄大的男性，其精子端粒长度反而长于年龄小的个体[34]。目前对于唾液斑中的口腔上皮细胞及头发毛囊端粒长度的研究数据很少。总体而言，血迹、精斑、唾液及毛发等常见法医物证的端粒长度测量方法及相关数据都不够完善，有待于进一步研究。

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作者单位：1.北京市红十字会急诊抢救中心司法鉴定中心，北京 100192

Review of Telomere Length for Forensic Age Estimation

YANG Ji-qing1, HUANG Zhao-yang2, LIANG Jie3, XIA Zhi-yuan4, ZHAI Xian-dun4, MO Yao-nan4

(1.Forensic Expertise Center of Beijing Red Cross Emergency,Beijing 100192,China; 2.The Public Security Bureau of Baoting County,Baoting 572300,China; 3.The Public Security Bureau of Wuzhishan City,Wuzhishan 572200,China; 4.College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo review the researches on the telomere length in different tissues or cell and its correlation to forensic age estimation. MethodsA systematic review was made by referring the latest literatures on the structure of telomere, the methods for measuring telomere length, its correlations to forensic age estimation as well as the influencing factors etc. ResultsTelomere length in different tissues or cells was significant correlation to forensic age estimation. ConclusionDetermination of telomere length is very helpful in forensic age estimation.

Key words:forensic medicine；age estimation；telomere

文章编号：1672-688X(2016)02-0156-05

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.027

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

基金项目：河南省基础与前沿课题(112300410082)
河南科技大学基金资助项目(09001309，13000914，13000696)

收稿日期：2016-03-06

作者简介：杨吉庆(1983-)，男，河南项城人，法医师，从事法医临床和法医病理学鉴定工作。

通信作者：莫耀南，男，博士，教授，硕士研究生导师，E-mail：forensic@haust.edu.cn