切断双侧内脏大神经对犬急性坏死性胰腺炎小肠免疫功能的影响

杨天保，孙君军，易　芳，杨延辉



切断双侧内脏大神经对犬急性坏死性胰腺炎小肠免疫功能的影响

杨天保1，2，孙君军1，易芳1，杨延辉1

摘要：目的探讨在切断内脏神经后对犬急性坏死性胰腺炎小肠免疫功能的影响。方法选取健康成年杂种犬17只，随机分为假手术组(SO组)5只、急性坏死性胰腺炎模型组(ANP组)6只和ANP+内脏大神经切断组(GSNT组)6只。分别于术前2 h，术后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d抽取外周静脉血，检测血浆淀粉酶。7 d后处死动物取小肠黏液检测SIgA浓度，取小肠组织行病理学检查和评分。实验中途死亡动物放弃实验数据，并做死因分析。结果血浆淀粉酶ANP组和GSNT组比较差异无统计学意义(P>0.05)；小肠黏液中SIgA浓度，GSNT组高于ANP组但低于SO组，差异有统计学意义(P<0.01)；小肠组织病理学评分，GSNT组高于ANP组但低于SO组，差异有统计学意义(P<0.01)；ANP组死亡1只。结论切断双侧内脏大神经可改善犬急性ANP时小肠的免疫功能，减轻小肠的病理损伤程度。

关键词：急性坏死性胰腺炎；内脏大神经；小肠免疫功能

2.河南科技大学临床医学院，河南洛阳 471003

急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreati-tis,ANP)是普外科常见的一种急危重症疾病，以发病凶险、病死率高著称。继发感染导致的全身炎症反应综合征及多器官功能衰竭是急性坏死性胰腺炎的重要死因，直接死于感染性休克的达19%[1]。ANP时肠道功能发生明显障碍[2]，患者常表现为腹胀、恶心、呕吐等。另外，细菌感染也是急性坏死性胰腺炎发病过程中的重要环节[3]，继发于急性坏死性胰腺炎感染的细菌主要是肠道菌群移位导致，这与肠道功能障碍密切相关[4-5]，而小肠的免疫功能对于维持肠道正常功能、防止细菌内毒素移位有重要作用[6]。内脏神经对于调节内脏器官的功能及维持机体内环境稳定有重要作用，“胆碱能抗炎通路”概念的提出使神经与炎症的关系成为近些年的研究热点，刺激迷走神经可产生抗炎作用[7-9]。本研究以犬ANP模型为基础，通过切断双侧内脏大神经，观察ANP时小肠病理学评分和黏液中SIgA的变化，为临床治疗急性坏死性胰腺炎提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料选取健康成年(2～3岁)雄性杂种犬17只，体质量10～15 kg；牛磺胆酸钠、胰蛋白酶均购自美国SIGMA公司；犬SIgA ELISA试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组随机分为假手术组(sham operation，SO组)5只、急性坏死性胰腺炎模型组(acute necrotizing pancreatitis，ANP组)6只和ANP+内脏大神经切断组(greater splanchnic nerve transection，GSNT组)6只。

1.2.2手术步骤①用舒泰50(犬全身麻醉药)按15 mg·kg-1行肌肉注射，全麻成功后取仰卧位四肢固定于犬专用手术台上，消毒、铺无菌单，取腹部正中切口，逐层切开皮肤进入腹腔。②解剖分离出左右内脏大神经，并挂线备用。③取距幽门约12 cm处纵行切开十二指肠前外侧肠壁约2 cm，找到十二指肠副乳头。沿副乳头开口插入直径1～2 mm的塑料导管(硬膜外麻醉导管)，置入主胰管5 cm左右，经微量注射泵(调整好压力后)，向主胰管内以7.6 kPa恒定压力注入50 g·L-1牛磺胆酸钠(0.5 mL·kg-1)和胰蛋白酶(3 000 U·kg-1)混合制剂诱导ANP(在注入诱导药物之前暂时夹闭胆总管)。注射完毕后即可见胰腺组织充血水肿，观察10 min后包膜下点状或片状出血坏死，表明ANP模型建立成功。④提起所有挂线，逐个剪断双侧内脏大神经干。⑤逐层关闭腹壁切口并消毒包扎。GSNT组按上述步骤进行。SO组在步骤2中仅分离神经，免去挂线；步骤3中以相同方法向胰管内注入等量生理盐水；免去步骤4，余步骤同GSNT组。ANP组仅免去步骤4，余步骤同GSNT组。整个手术过程严格按照无菌原则进行操作。

1.2.3术后维持全部动物制模完成后，禁食、禁饮，行完全肠外营养(每日氨基酸液2.0 g·kg-1、20%脂肪乳剂2.0 g·kg-1、50%葡萄糖4.0 g·kg-1、氯化钾1.0 g、氯化钠1.5 g，总补液量为每日70 mL·kg-1，手术期间和术后8 h内适当增加补液量)。

1.2.4标本采集及检测分别于术前2 h，术后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d抽取外周静脉血3 mL，3 000 r·min-1，离心15 min取上清液，保存于-80 ℃冰箱待测；术后7 d处死实验动物取距回盲瓣10 cm的小肠组织，纵行剖开肠壁，用干净的载玻片轻轻刮取肠黏膜表面黏液置于试管内，并加入2 mL PBS液充分振荡混匀，3 000 r·min-1，离心15 min取上清液，保存于-80 ℃冰箱待测；取距回盲瓣15 cm处小肠2 cm，使用眼科剪剪成1 cm×1 cm大小组织块，常规制作病理切片，行HE染色。血浆淀粉酶采用全自动生化分析仪(日本东芝TBA-2000FR)进行检测；小肠黏液SIgA应用酶联免疫反应法，使用全自动酶标仪(意大利SEAC，ALISEI.Q.S)进行定量检测；小肠病理切片按照文献报道的方法进行病理学评分[10]。(在HE染色情况下对肠黏膜绒毛、固有层、毛细血管、炎性组织浸润等情况进行评价。)

1.2.5统计学处理使用SPSS 17.0软件包对数据进行重复测量的方差分析、SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血浆淀粉酶水平术前2 h，3组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；术后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d，ANP组和GSNT组分别与SO组比较，血浆淀粉酶活性均显著增高，差异均有统计学意义(均P<0.01)；在术后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d，GSNT组与ANP组血浆淀粉酶活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

①术后各时间点与SO组比较，P<0.05；②术后各时间点与ANP组比较，P>0.05。SO组：假手术组；ANP组：急性坏死性胰腺炎模型组；GSNT组:ANP+内脏大神经切断组。图1　3组血浆淀粉酶各时间点变化情况

2.2小肠黏液中SIgA水平ANP组和GSNT组分别与SO组比较，小肠黏液中SIgA浓度均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)；GSNT组小肠黏液中SigA高于ANP组(P<0.05)，见表1。

2.3小肠组织病理学评分ANP组和GSNT组分别与SO组比较，小肠病理学评分均明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；GSNT组小肠病理学评分明显低于ANP组(P<0.05)，见表1。

表1　3组间小肠黏液SIgA浓度和病理学评分比较

注：①与SO组比较，P<0.05；②与ANP组比较，P<0.05。SO组：假手术组；ANP组：急性坏死性胰腺炎模型组；GSNT组:ANP+内脏大神经切断组。

2.4ANP组死亡1只死亡动物死因分析，病理解剖显示其死于感染性休克、多器官功能衰竭。

3讨论

本研究选用大型动物犬，因其胰腺组织发达，且解剖结构及生理功能与人类较为相似，实验结果对临床更具指导意义[11]。胰腺淀粉酶是评价急性胰腺炎的经典指标，本研究结果显示，ANP组造模成功后较术前明显升高(P<0.01)，但是术后各时间点ANP组与GSNT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结合术后注射造模药物后胰腺组织明显发生弥漫性充血水肿，并出现点片状的出血坏死，由此成功建立ANP模型。

肠屏障功能包含机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障，正常的肠屏障功能可抵御肠道内抗原物质损伤肠黏膜，还可以防止正常寄居于肠道的细菌、毒素移位至其他组织器官，对于维持机体微环境稳定有重要作用。小肠的免疫屏障主要由肠黏膜相关淋巴组织、黏膜固有层淋巴细胞及肠道内浆细胞分泌的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)组成，通过体液免疫和细胞免疫共同抵御有害物质的侵袭。生理状态下肠道通过细胞免疫和体液免疫，既能对食物抗原产生免疫耐受，又可监控、清除致病物质，其中由浆细胞分泌至肠腔表面的SIgA在维持肠道免疫功能中有重要作用。SIgA可与细菌表面携带的抗原结合，阻止其与肠上皮细胞的黏附，从而阻止了细菌对肠壁的侵袭[12]。ANP时机体免疫功能发生紊乱，胃肠道的免疫功能也发生障碍，肠黏膜相关淋巴组织内淋巴细胞数量减少，散在分布的淋巴细胞也受到破坏。有研究发现，在ANP发生的早期阶段由浆细胞分泌至肠道表面的SIgA已有显著减少[13]。自主神经系统中交感神经与副交感神经的分支在调节免疫功能中起着重要作用[14]，Borovikova在2000年首次提出了“胆碱能抗炎通路”的概念[9]，表明刺激迷走神经可产生抗炎作用。ANP是一种典型炎症性疾病，ANP时致炎细胞因子TNF-α、IL-1β明显升高，切断内脏大神经后则致炎细胞因子TNF-α、IL-1β明显降低，抗炎细胞因子IL-10明显升高，且胰腺病理损伤明显减轻[15]。本研究结果显示，ANP组小肠黏液中SIgA浓度明显较SO组降低，表明ANP时肠道免疫功能障碍。然而，GSNT组小肠黏液中SIgA浓度明显较ANP组高，表明切断双侧内脏大神经可改善小肠的免疫功能，这种作用可能与分布于小肠的迷走神经失去交感神经抑制时活动性增强，其神经末梢释放的乙酰胆碱增加，作用于肠道内的B淋巴细胞，促使其增殖活化合成分泌免疫球蛋白增加相关。术后7 d小肠组织的病理学评分也显示GSNT组评分明显低于ANP组，即内脏大神经切断后小肠病理损伤程度明显减轻，表明内脏大神经切断对小肠组织有保护作用。

综上所述，内脏大神经在犬急性坏死性胰腺炎时对小肠免疫功能有一定的调节作用，切断内脏大神经可改善免疫细胞的活性，提高SIgA的分泌量，减轻小肠的病理损伤程度，对急性坏死性胰腺炎有一定的治疗作用。

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作者单位：1.河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003

Effect of Small Intestinal Immunological function after Cutting off the Bilateral Greater Splanchnic Nerve in the Dog with Acute Necrotizing Pancreatitis

YANG Tian-bao1,2, SUN Jun-jun1, YI Fang1, YANG Yan-hui1

(1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.College of Clinical Medicine of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo research the effect of small intestinal immune after bilateral greater splanchnic nerve transection in dog with acute necrotizing pancreatitis.Methods17 mongrel heath dogs were randomly divided into three groups, sham operation group (SO group) 5, acute necrotizing pancreatitis model group (ANP group) 6, and ANP with bilateral greater splanchnic nerve transection group (GSNT group) 6. The plasma levels of pancreatic amylase were monitored at 2 hours before operation. 2 hours, 12 hours, 24 hours, 3 days, 5 days and 7 days after operation. At post-operation 7 days all animals were killed, small intestinal mucous was collected to detect the level of SIgA, and a section small intestinal was collected to make pathological examination and score. If the animals were dead in process of experiment, all the related data would be abandoned, but the cause of death was investigated.ResultsThere were no significant difference between ANP group and GSNT group on the levels of plasma pancreatic amylase (P>0.05). The concentration of SIgA from small intestinal mucous was obvious reducing in ANP group and GSNT group compared with SO group (P<0.01), besides it was higher in GSNT group than ANP group(P<0.01). The pathological scores of small intestinal among the three groups, the ANP group and GSNT group scores were higher than that of SO group (P<0.01), while GSNT group was lower than ANP group(P<0.05). The ANP group had a dead animal in the experiment.ConclusionCutting off bilateral greater splanchnic never could improve small intestinal immunological function and alleviate the degree of small intestinal damage.

Key words:acute necrotizing pancreatitis；spalnchnic nerve；small intestinal immune

文章编号：1672-688X(2016)02-0087-04

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.003

中图分类号：R657.5+1;R392.32

文献标志码：A

收稿日期：2016-03-14

作者简介：杨天保(1988-)，男，河南漯河人，从事普外科疾病的临床与基础研究工作。