3种椎动脉型颈椎病大鼠模型的建立与评价

宋　敏，李清林，孙定平，巩彦龙，刘　涛，柴居堂，董万涛

(1. 甘肃中医药大学，甘肃兰州　730000；2. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州　730000)



3种椎动脉型颈椎病大鼠模型的建立与评价

宋敏1，李清林1，孙定平1，巩彦龙1，刘涛1，柴居堂2，董万涛2

(1. 甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730000)

摘要：目的通过对3种椎动脉型颈椎病(CSA)模型大鼠学习记忆能力、焦虑抑郁度及神经精神紧张度的测定，对CSA大鼠造模方法进行比较和评价。方法将120只大鼠随机分为混合造模组、植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组和空白对照组，每组30只，通过Morris水迷宫、高架十字迷宫实验及旷场实验对大鼠的学习记忆能力、焦虑抑郁度及神经精神紧张度进行检测和比较，对3种CSA大鼠模型进行评价。结果与空白对照组比较，混合造模组、植骨压迫造模组及力学平衡失调造模组的大鼠学习记忆能力明显下降,焦虑抑郁度及神经精神紧张度明显增高(P<0.05)；与植骨压迫造模组及力学平衡失调造模组比较，混合造模组能更好的还原CSA发病特征。结论3种造模方法均可以成功复制CSA动物模型，其中混合造模法更为优异，值得推广。

关键词：混合造模法；椎动脉型颈椎病；造模评价

椎动脉型颈椎病(cervical spondylosis of vertebral artery type, CSA)是颈椎病的常见类型之一，占颈椎病的10%～15%[1-2]，临床主要表现为眩晕、紧张多虑、视觉异常、植物神经功能紊乱及抑郁、记忆力减退、睡眠障碍等精神症状，严重者甚至发生猝倒、晕厥[3]。既往实验研究中，涉及大鼠的CSA经典造模方法有植骨压迫造模法和力学平衡失调法[4-5]。本研究在既往研究的基础上，提出混合造模法，并与经典造模法进行比较，通过对大鼠学习记忆、焦虑抑郁及神经精神三种行为学指标的观测对比，以确证混合造模法所致CSA大鼠模型的实验价值，为CSA的后续治疗研究提供更适宜的动物模型。

1材料与方法

1.1实验动物6月龄SPF级健康Wistar雄性大鼠120只，体质量(300±20)g(生产许可证号为SCXK(甘)2011-0001)，由甘肃中医药大学实验动物中心提供。动物购进后安静状态下适应性饲养1周，饮水饲料充足，光照节律12L/12D(7∶00～19∶00)，温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%。

1.2主要实验仪器Morris水迷宫及动物行为视频分析系统、高架十字迷宫及动物行为分析系统、旷场实验及分析系统等。

1.3分组造模适应期后将所有大鼠随机分为植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组、混合造模组和空白对照组，每组30只。

1.3.1植骨压迫造模组0.6 g/L水合氯醛按1.0 mg/kg行大鼠腹腔注射麻醉，颈部脱毛、消毒后，取颈背部正中纵形切口(自寰枕关节至T2处)，开放右侧颈部肌肉，分离C5、C6椎体前方颈长肌，显露椎体及其横突的前方，切除横突间骨翼，分离椎动脉内侧的骨膜至椎体后方，将5 mm长，1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm的骨块植入骨膜下间隙，逐层缝合椎体前方筋膜及组织，最后缝合肌肉，防止骨块前移，形成右侧颈椎失稳。止血满意后缝合切口，碘伏消毒，外敷消毒纱布保护，术后给予青霉素抗感染治疗，单鼠单笼饲养。

1.3.2力学平衡失调造模组麻醉方法同上。颈部脱毛、消毒后，取颈背部正中纵形切口(自寰枕关节至T2处)，切开皮肤及皮下筋膜组织，分离切除左侧颈阔肌，再分别钝性分离切除左侧颈斜方肌、颈部夹肌、头颈菱形肌、最长肌、颈髂肋肌及半棘肌，切断颈阔肌，头、颈、寰最长肌，颈骼肋肌和头半棘肌，并切除(5±2.5)mm以免断端愈合，逐层缝合，形成左侧肌力失衡。术后处理同上。

1.3.3混合造模组处理方法采取合并植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组法，开放颈部后，左侧采取力学平衡失调法处理，右侧采取植骨压迫法处理。术后处理同上。

1.3.4空白对照组不做任何处理。所有动物术后适应性喂养2周，第3周开始进行相关检测。

1.4测量指标及方法

1.4.1学习记忆能力检测采用Morris水迷宫实验。 包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时3 d，每天训练3次，每次训练2 min。在安静的环境下，每次随机选择一个象限让大鼠入水，大鼠入水时面向池壁，找到隐藏平台后立即停止试验。记录大鼠从开始入水到找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期，以检测大鼠的空间学习能力。若大鼠在2 min内找不到平台，则记录其逃避潜伏期为120 s。待第3天的定位航行实验结束后即进行空间探索实验：将平台去掉，将大鼠任选一象限入水，时间2 min，记录大鼠2 min内在平台所在象限停留的时间和穿越原平台所在位置次数，以检测大鼠的空间记忆能力。120 s后大鼠还找不到平台的，引导其到平台上休息60 s，记录每只大鼠每次找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度，取四个象限平均值为该次实验的数据。实验每天进行4次，持续5 d。

1.4.2焦虑抑郁度检测采用高架十字迷宫实验。 在安静的环境下，将大鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫，观察指标包括：进入开放臂次数，开放臂停留时间，进入闭合臂次数，闭合臂停留时间。计算开放臂停留时间比例，开放臂进入次数比例，高架十字迷宫中总进入次数。记录5 min内的活动情况，实验完成后将小鼠取出，将两臂清理干净，喷洒酒精除去气味，最后用Xeye动物行为学软件进行数据分析。进入开放臂次数及停留时间与大鼠的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越短，说明大鼠的焦虑情绪越严重。

1.4.3神经精神紧张度检测采用旷场实验。 在安静的环境下，将动物放入箱内底面中心，开始摄像，记录时间5 min。记录指标包括：中央格停留时间，肢体越过的格子总数，后肢站立次数，修饰次数，总运动距离，沿边运动距离，中央运动距离等。每只大鼠测定结束后，清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)影响下次测试结果。

2结果

2.14组大鼠脱落情况各组大鼠造模术后因麻醉或感染出现脱落情况比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表14组大鼠术后脱落情况比较

Tab.1Comparison of the four groups of rats after the operation

组别总数脱落数脱落比例(%)植骨压迫造模组30310.00力学平衡失调造模组3026.67混合造模组30516.67空白对照组300 0

经Fisher确切概率法χ2检验，P>0.05。

2.2Morris水迷宫实验结果4组大鼠7 d内学习记忆数据分析显示，从第1天到第7天，同一组大鼠在不同时间段学习记忆能力均值的差异具有统计学意义，随时间延长，学习时间变短，记忆能力增强(P<0.01)；不同组之间学习记忆能力比较，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.3高架十字迷宫实验结果大鼠进入中央区、开放臂区的次数比较：混合造模组明显少于其他3组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.05)；植骨压迫造模组与力学平衡失调造模组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。进入封闭臂区次数比较：混合造模组、植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组大鼠与空白对照组对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

混合造模组大鼠在中央区及开放臂区停留时间均低于空白对照组及植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；在封闭臂区的停留时间明显多于空白对照组及植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组(P<0.05，P<0.01)；植骨压迫造模组和力学平衡失调造模组在中央区及开放臂区停留时间少于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.05)，在封闭臂区停留时间明显多于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，表3)。

表24组大鼠Morris实验学习记忆能力比较

Tab.2Comparison of the learning and memory ability of four groups of rats tested with Morris water maze

±s; s)

与混合造模组比较，*P<0.05，**P<0.01；与空白对照组比较，△P<0.05。

表34组大鼠高架十字迷宫实验结果比较

Tab.3Comparison of experimental results of the four groups of rats in the elevated plus maze

±s)

与混合造模组比较，*P<0.01；与空白对照组比较，△P<0.05。

2.4旷场实验结果混合造模组大鼠在站立次数、跨格数、修饰次数、运动总距离、沿边运动距离及中央运动距离分别与其他3组比较，均显著减少 (P<0.05，P<0.01)；植骨压迫造模组、力学平衡失调造模组与空白对照组比较亦明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.05，表4)。

3讨论

动物模型的建立是实验研究以及临床研究的基础，能够较好的复制动物模型是促进实验动物学发展，更好的指导临床研究的保证。本课题组在分析探究以往CSA动物造模的基础上，大胆提出混合造模法，以期追求造模的成功率，较高程度的复制CSA临床症状特点，基本符合临床发病条件。

表44组大鼠矿场实验自主探究行为比较

Tab.4The comparison of independent search in field experiments in the four groups

±s)

与混合造模组比较，*P<0.01；与空白对照组比较，△P<0.05。

研究指出[6-8]，CSA发病与神经-内分泌-免疫(NEI)调节网络有密切关系，发病过程中，颈椎退行性变引起钩椎关节骨质增生、小关节移位、颈部肌肉痉挛、颈交感神经兴奋/抑制等，造成椎-基底动脉系统缺血及颅内供血障碍[9]，激惹NEI调控机制，使机体发生应激反应，出现眩晕、头痛、视物模糊、记忆力下降等症状[10]。本研究结合CSA的发病机制，采取离断大鼠部分颈部肌肉并在一侧骨膜下压迫植骨的混合造模方法，模拟出颈椎退行性变的假象，构建椎-基底动脉缺血、神经细胞变性凋亡、组织慢性缺血缺氧、血管微循环紊乱的CSA发病条件，以最大可能的模仿CSA临床发病机制。造模后，大鼠的病理状态虽然与人有一定差距，但疾病所致的行为学等与人相似，同时还存在复杂的神经内分泌改变[11-13]。

CSA临床主要表现为眩晕、眼花、记忆力下降、焦虑等，而Morris水迷宫实验、高架十字迷宫实验及旷场实验三种实验方法是针对CSA发病特点设计的检测方法。Morris水迷宫用于研究与空间学习记忆相关的脑区功能评价，在世界上已经得到广泛的认可，是行为学研究尤其是学习与记忆研究的首选经典实验方法。本实验应用Morris水迷宫对造模后的大鼠记忆能力进行测评，结果表明4组大鼠7 d内学习记忆能力有明显差异，并且随时间延长，学习记忆能力逐渐增强，但混合造模组较其他三组记忆力明显减退，说明混合造模组大鼠出现记忆力下降，符合CSA发病特点。高架十字迷宫实验是利用啮齿动物被放入高架十字迷宫后会主动探究开臂，但又惧怕开臂中高悬敞开的环境，由此形成的矛盾冲突状态，常用于焦虑研究。该实验采用视频跟踪技术完成了高架十字迷宫实验的自动化和定量化，结果更加真实、可信、客观，重复性好。本组实验结果显示，混合造模组与其他三组比较，大鼠探究能力明显下降，说明造模组大鼠焦虑抑郁较明显。旷场实验是观察评价实验动物神经精神紧张度的一种实验方法。CSA发病的特点之一是紧张多虑、神经紊乱，本实验采用旷场实验方法，检测动物造模后神经精神紧张度。结果表明混合造模组大鼠各种行为指标明显低于其他3组，说明混合造模组大鼠较其他3组大鼠精神更加紧张。

对3种造模方法进行比较研究显示，混合造模法、力学平衡失调造模法及植骨压迫造模法制备的CSA模型大鼠在学习记忆能力、焦虑抑郁度和神经精神紧张度等方面明显优于空白对照组，说明3组大鼠在造模后其行为学基本符合CSA临床发病特点；而混合造模组CSA大鼠在学习记忆能力、焦虑抑郁度以及神经精神紧张度三个方面明显优于力学平衡失调造模组和植骨压迫造模组，说明混合造模组相对于其他两组能更好的还原CSA发病特征，验证了本课题组提出的CSA大鼠混合造模法符合CSA动物造模要求。

目前CSA造模方法较多，哪种模型能更好地模拟CSA临床病理机制尚不清楚，因此，应把动物模型的研究和临床实际结合起来，这样动物模型的研究才更具有意义。在动物造模过程中应综合考虑多种因素：①动物品系和数量的确定；②动物随机和对照原则的体现；③合理的模型评价标准；④中西医结合模拟CSA动物模型[14]。CSA是临床多发性疾病，深入研究具有重要的意义，混合造模方法虽然可以模拟出CSA发病状态，但能否完全模拟临床CSA发生机制尚需进一步研究证实。本课题组将在此研究的基础上，进一步从细胞及分子水平解释CSA混合造模方法，不断的丰富CSA造模理论，推动CSA病理机制和防治研究的发展。

参考文献：

[1] LE BB, BARALLOBRE MJ, HOMMAN L, et al. VEGF-C is a trophic factor for neural progenitors in the vertebrate embryonic brain[J]. Nat Neurosci, 2006, 9(3):340-348.

[2] ROSENSTEIN JM, KRUM JM. New roles for VEGF in nervous tissue-beyond blood vessels [J]. Exp Neurol, 2004, 187(2):246-253.

[3] 董万涛，宋敏，吕泽斌，等. 活血定眩胶囊治疗椎动脉型颈椎病临床疗效评价[J]. 中国中医药信息杂志, 2014, 21(1):33-35,39.

[4] 王欢，李雷，王海义. 椎动脉受压动物模型[J]. 中国医科大学学报, 1997, 26(2):49-51.

[5] 张军，齐越峰，孙树椿. 家兔颈椎两侧肌肉平衡失调对椎动脉血流的影响[J]. 中国骨伤, 2002, 15(5):28-29.

[6] BESEDOVSKY HO, DEL REY A. A central and peripheral cytokines mediate immune-brain connectivity[J]. Neurochem Res, 2011, 36(1):1-6.

[7] STASI C, BELLINI M, COSTA F, et al. Neuroendocrine markers and psychological features in patients with irritable bowel syndrome[J]. Int J Colorectal Dis, 2013, 28(9):1203-1208.

[8] STASI C, ROSSELLI M, BELLINI M, et al. Altered neuro-endocrine-immune pathways in the irritable bowel syndrome: the top-down and the bottom-up model[J]. J Gastroenterol, 2012, 47(11):1177-1185.

[9] STAYMAN A, NOGUEIRA RG, GUPTA R. Diagnosis and management of vertebrobasilar insufficiency[J]. Curr Treat Options Cardiovasc Med, 2013, 15(2):240-251.

[10] 吴学元，张党锋，刘洪亮，等. 椎动脉型颈椎病外科治疗效果的观察[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2013, (5):690-691.

[11] 曹碧茵，施建蓉，童瑶，等. 心理应激动物模型的研制及其应用[J]. 中国行为医学科学, 2005, 14(2):191-192.

[12] 王玮文，邵枫，林文娟. 不同时程应激对大鼠行为、免疫和交感神经系统反应的影响[J].心理学报, 2007, 39(2):292-298.

[13] 李宁，唐启盛，侯秀娟，等. 广泛性焦虑大鼠前额叶皮质和海马磁共振波谱的研究[J]. 波谱学杂志, 2010, 27(2):185-193.

[14] 柴居堂，宋敏，董万涛，等. 椎动脉型颈椎病动物模型国内研究进展及评价[J]. 中国中医骨伤科杂志, 2015, 1(23):26-30.

(编辑邱芬)

Establishment and evaluation of three kinds of cervical spondylosis of vertebral artery type rat model

SONG Min1, LI Qing-lin1, SUN Ding-ping1, GONG Yan-long1,LIU Tao1, CHAI Ju-tang2, DONG Wan-tao2

(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2. the Affiliated Hospital of Gansu University of TCM, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo compare and evaluate the methods of building model of cervical spondylosis of vertebral artery type (CSA) rats by measuring the learning and memory ability, anxiety and depression, and degree of nervous tension of three kinds of CSA model rats. MethodsWe randomly divided 120 rats into mixed modeling group, bone graft compression modeling group, mechanical balance disorder modeling group, and blank control group with 30 rats in each. Morris water maze, elevated plus maze test and open field test were used to detect and compare the rats’ abilities of learning and memory, anxiety and depression, and degree of nervous tension. We then evaluated the three CSA rat models. ResultsCompared with those in the blank group, the learning and memory abilities in the mixed modeling, bone graft compression and mechanical balance disorder modeling rats were significantly decreased, the anxiety and depression and degree of nervous tension were significantly increased (P<0.05). Compared with bone graft compression and mechanical balance disorder modeling groups, the mixed modeling group could restore the characteristics of CSA. ConclusionThe three kinds of modeling methods can successfully reproduce the CSA animal model; the mixed modeling is superior and thus worthy of promotion.

KEY WORDS:hybrid modeling method; cervical spondylosis of vertebral artery type; modeling evaluation

收稿日期：2015-09-29修回日期：2015-12-07

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81360554)；甘肃省重点中医药科研立项课题(No.GZK-2010-Z14)；甘肃省中药现代制药工程研究院项目开发(No.2305083306)；甘肃省高等学校研究生导师科研项目(No.1206-01)

通讯作者：李清林. E-mail: qinglin27@126.com

中图分类号：R681.5

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201603032

◇技术方法研究◇

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81360554), the Key Chinese Medicine Research Project of Gansu Province (No.GZK-2010-Z14), the Project Development of the Modern Pharmaceutical Engineering Research Institute of Chinese Medicine in Gansu Province (No.2305083306), and the Research Project of Graduate Students’ Advisor in Colleges and Universities of Gansu Province (No.1206-01)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160419.0951.002.html(2016-04-19)