ISSR分子标记在白芍亲缘关系的应用研究＊

蒋雨晗，张丽萍，周学刚，王艳芳

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

ISSR分子标记在白芍亲缘关系的应用研究＊

蒋雨晗，张丽萍＊＊，周学刚，王艳芳

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

目的：研究安徽、山东、北京、四川的栽培白芍和山西野生白芍的遗传多样性和亲缘关系，确定不同产区的白芍种质资源的差异，为白芍育种研究提供一定参考。方法：运用ISSR分子标记技术，研究14份材料的遗传多样性水平。结果：选择条带清晰、多态性高、重复性好的7条引物进行扩增，共获得56条片段，其中多态性条带38条，平均多态性比率为67.86%；运用NTSYS软件计算样品间的遗传相似系数（GS值），得到样品间遗传相似系数矩阵，其中亳州1号和亳州2号间相似系数最大，这说明两者间亲缘关系较近，遗传差异小；北京2号和山西野生白芍相似系数最小，说明两者间亲缘关系较远，遗传差异大；利用UPGMA法，根据遗传相似系数对各样品进行聚类分析，在GS值为0.72时把14个样品分为两大类群，北京和安徽栽培白芍为一个类群，其他品种为另一个类群。结论：4个产区的栽培白芍和山西野生白芍存在一定的遗传差异性，可以从基因水平把植株外型相似的栽培品种区分开，对新品种的选育有很大的意义。

白芍ISSR分子标记亲缘关系

白芍为毛茛科芍药属芍药PaeonialactifloraPall.经去皮水煮加工后的干燥根，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳之功效[1]，主治胸胁疼痛、自汗盗汗、阴虚发热、月经不调、崩漏带下等症[2]。白芍主要化学成分有芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等[3]。现代药理研究表明，芍药总苷具有止痛、抗炎、保肝以及多途径抑制自身免疫反应等作用[4]，在心血管疾病和肝病的治疗上已成为未来研究的重点[5]。白芍主产于中国安徽、四川、山东、浙江等地[6]，中国医学科学院药用植物研究所多年来对各产地白芍种质资源进行收集，并进行了初步品种选育筛选出数个品系，本研究把这数个品系作为北京产白芍列入研究范围。

白芍是中国传统常用大宗中药材，种植面积大，品种繁多，但其种质资源的混乱阻碍了白芍的可持续发展。白芍品种的传统鉴定方法主要从植株外型特征和化学成分上进行区分，随着分子生物技术的发展，从分子水平对白芍种质资源有了更深一步的认识。ISSR分子标记技术近年来被广泛应用于药用植物品种鉴定、亲缘关系以及遗传多样性的研究[7]。其中，于恒秀等[8]运用ISSR引物研究栽培芍药品种间的亲缘关系表明“蓝田碧玉”与其他研究品种亲缘关系较远；王淼等[9]通过研究优化了芍药ISSRPCR反应体系并把所研究的芍药品种分为3个类群。目前，药用白芍的相关报道较少，对各个产区栽培的药用白芍的研究不够全面。因此，本研究运用ISSR分子标记技术对4个产地的栽培白芍和山西野生白芍的亲缘关系进行研究，分析白芍的遗传多样性，以期为白芍的育种提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北京产白芍原植物种植于中国医学科学院药用植物研究所试验田，经张丽萍研究员鉴定为毛茛科芍药PaeonialactifloraPall.。样品采集方法：每间隔5 m左右标记采样单株，每株采集正常生长的新鲜叶片4-5片，放入装有无水硅胶的自封袋中干燥。样品情况见表1。

表1 试验样品情况

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

取白芍叶片100 mg，采用CTAB法提取叶片基因组总DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和纯度。

1.2.2 ISSR反应体系和扩增条件

ISSR反应体系共20 μL：ddH2O 7.8 μL，（蓝）MIX 10 μL，引物（100 μm）0.2 μL，DNA模板2 μL。ISSR-PCR扩增程序：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，54℃复性30 s，72℃延伸2 min，共33个循环；最终72℃延伸10 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在紫外成像仪上观察、拍照。

1.2.3 引物的筛选

通过查阅芍药及其近缘科属ISSR-PCR实验的相关文献，从中初步筛选出常用扩增的ISSR引物20条[10，11]（见表2）。选择编号为1、3、5、8、9的5个样本对这20条引物进行扩增，筛选出多态性高、稳定性好的引物以期为所有样品的扩增。

表2 引物信息表

1.2.4 数据统计与分析

PCR扩增产物的电泳位置在凝胶的某个相同迁移率位置上，有DNA条带记为1，无DNA条带记为0。形成ISSR的表型数据矩阵，NTSYS软件计算相似系数，并且按照遗传距离进行UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

从20条ISSR引物中筛选出了7条能够扩增出清晰条带且具多态性的引物，筛选出的引物编号：0531-018、UBC881、UBC808、UBC811、UBC835、UBC836、UBC842。

2.2 ISSR-PCR实验结果

利用ISSR分子标记技术对14份白芍样本进行遗传多样性分析，从20条引物中筛选出7条能够扩增出清晰条带且具多态性的引物，共获得56条清晰可辨条带，其中多态性条带 38条，平均多态性比率为67.86%，扩增的DNA片段集中在200-2 000 bp上下。平均每对引物扩增出8条条带，其中5.429条具有多态性。其中，多态性最高的为87.50%，低的只有57.14%。其中引物0531-018对14份白芍种质资源扩增图（图1）。7条引物总体扩增情况见表3。

2.3 样本亲缘关系的分析

2.3.1 遗传相似系数

利用7条引物在14份白芍叶片获得的56条扩增片段，在NTSYS软件中计算样品间的遗传相似系数（GS值），得到供试材料遗传相似矩阵（见表4）。遗传相似系数越大，表明亲缘关系越近，遗传相似系数越小，表明亲缘关系越远。由表3可知14份样品的GS值范围为：0.625 0-1.000 0，变幅为0.375。其中，亳州1号、亳州2号样品之间的遗传相似系数最大为1.000 0，表明两者之间的亲缘关系较近，遗传差异性小。北京1号、北京2号和山西野生品种，北京2号和山东昆山霞光样品之间的遗传相似系数最小为0.625 0，表明这几个样品之间的亲缘关系较远，遗传差异性较大。由遗传相似系数可知，供试样品之间有较大的遗传差异性。

2.3.2 聚类分析

根据遗传相似系数矩阵，利用UPGMA法进行聚类分析，聚类图见图2。

图1 引物 0531-018 对 14 份白芍种质资源扩增图谱

表3 7对引物扩增结果统计

表4 14个样本遗传相似系数矩阵

图2 14份白芍种质材料的UPGMA聚类图

由以上聚类分析图可以看出，在GS值为0.72时把14份样本分为两大类：①北京品种和安徽品种；②其他品种。其中，北京和安徽品种均为单瓣花型，四川和山东品种为重瓣花型。这也与实验分析结果基本一致，说明单瓣型白芍和重瓣型白芍具有明显的差异性，同时发现山西野生单瓣型白芍和重瓣的栽培品种遗传差异性较小。从遗传相似系数和聚类分析图可知，亳州1号和亳州2号基本没有遗传差异，而北京品种和安徽品种具有一定的遗传差异，从分子水平可以把两者区分开。

根据以上遗传差异性分析结果可知，不同产区的白芍具有一定的遗传差异性，而同一产区不同品种之间也存在差异。本次研究结果表明，北京和安徽两个产区栽培白芍亲缘关系较近，山西野生品种和四川、山东产区栽培白芍亲缘关系较近，而北京、安徽产区的白芍和山东、四川以及山西野生品种的白芍亲缘关系较远。

3 讨论

运用ISSR分子标记技术对安徽、北京、山东及四川栽培品种白芍和山西野生白芍进行研究，安徽和北京栽培品种在植株外型上都属于单瓣花型，山东和四川栽培品种植株外形上属于重瓣花型，从基因水平上对栽培白芍进行研究，更具体的确定栽培白芍品种间的遗传距离和亲缘关系的远近。

本研究结果表明，ISSR分子标记技术能有效检测栽培白芍种质材料的遗传多样性，揭示白芍遗传背景，从聚类分析图可以判别栽培白芍遗传距离的大小和亲缘关系的远近，对选育新品种具有重要的意义。

另外，本次实验所选引物多是从哥伦比亚大学设计并所公布的100条引物中选取，共性大。可以对芍药属引物进一步开发，使引物更具有各自的特性，实验结果更明确。

1 国 家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社, 2015: 105.

2 李 雪莲,来平凡.白芍品种的本草学研究及现代实验研究.亚太传统医药. 2008, 4(5): 36-38.

3 Z hu S,Yu X, Wu Y. Genetic and chemical characterization of white and red peony root derived from Paeonia lactiflora.J Nat Med-Tokyo, 2015, 69(1): 35-45.

4 李 文艳,黄山君,王瑞.中药白芍的药理作用和质量控制研究进展.药学服务与研究. 2012, 12(2): 118-122.

5 王 秋玲,马运运,孙云波,等. 药用芍药发明专利格局与发展分析.世界科学技术-中医药现代化. 2014, 16(7): 1476-1481.

6 查 良平,杨俊,彭华胜,等.四大产地白芍的种质调查. 中药材. 2011, 34(7): 1037-1040.

7 孙 稚颖,姚辉,王振中,等.金银花种质资源遗传多样性的ISSR分析.世界科学技术-中医药现代化. 2013, 15(9): 1890-1895.

8 于 恒秀,王淼,梁国华,等. ISSR引物鉴定芍药栽培品种之间亲缘关系的初步研究. 植物生理学通讯. 2006, 42(2): 271-274.

9 王 淼,于恒秀,龚志云.芍药栽培品种ISSR反应体系的优化和应用.扬州大学学报(农业与生命科学版). 2007, 28(2): 78-82.

10 周 佐斌. 白芍原植物种质资源遗传多样性的ISSR分析.南昌:南昌大学, 2007, 59.

11 索 立志.利用DNAISSR分子标记技术对芍药属植物栽培品种的分类鉴定方法.生物技术通报. 2008,增刊: 109-112.

Application Research on Relationship of Paeonialactiflora Pall. by ISSR

Jiang Yuhan, Zhang Liping, Zhou Xuegang, Wang Yanfang
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

The purpose of this experiment was to study the genetic diversity and phylogenetic relationship ofPaeonialactifloraPall. from Anhui, Shandong, Beijing, Sichuan and Shanxi, and to provide guidance for the germplasm and breeding research inPaeonialactifloraPall. Inter-simple sequence repeat (ISSR) was conducted to assess the genetic diversity of 14PaeonialactifloraPall. cultivars. The results showed that 7 ISSR primers with clear and stable polymorphic bands were selected. In the 56 fragments obtained, 38 were polymorphisms, and the percentage of polymorphic fragment was up to 67.86%. The GS was calculated by NTSYS, among the coefficient matrix of 14PaeonialactifloraPall. The GS between Bozhou 1 and Bozhou 2 were the highest, which indicated they had lower genetic diversity level, while Beijing 2 and Shanxi were opposite. Based on UPGMA and ISSR molecular markers, the 14PaeonialactifloraPall. cultivars were divided into two groups at the GS of 0.72. Beijing and Anhui were in one group, others were in the other group. It was concluded that a higher genetic diversity level among the 14PaeonialactifloraPall. cultivars and they can be distinguished on genetic level. The result was significant for the breeding.

PaeonialactifloraPall., ISSR molecular markers, phylogenetic relationship

10.11842/wst.2016.03.015

R931.2

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2015-11-10

修回日期：2016-01-07

＊ 科学技术部国家科技重大专项“重大新药创新”项目（2012ZX09304006-056）：中药材种子种苗和种植（养殖）标准平台，负责人：张丽萍。

＊＊ 通讯作者：张丽萍，研究员，主要研究方向：药用植物规范化种植。