二甲双胍对NASH小鼠肝组织NF-κB活性、血清IL-6与转氨酶水平的影响

郭中秋，史治宙，赖康保，廖庆辉，谭娅琴，陈玉华，刘荣火

深圳市龙岗区人民医院内分泌科，广东 深圳 518172

二甲双胍对NASH小鼠肝组织NF-κB活性、血清IL-6与转氨酶水平的影响

郭中秋，史治宙，赖康保，廖庆辉，谭娅琴，陈玉华，刘荣火

深圳市龙岗区人民医院内分泌科，广东 深圳 518172

目的 观察二甲双胍对非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠的肝组织NF-κB活性、血清白介素6(IL-6)表达及转氨酶影响，并探讨二甲双胍防治NASH的可能机制。方法 24只昆明小鼠随机分为3组:对照组、模型组、治疗组。凝胶迁移率变动分析(EMSA)检测小鼠肝组织NF-κB活性；ELISA法检测小鼠血清IL-6表达；全自动生化仪检测小鼠转氨酶水平，了解各组小鼠肝脏损伤情况。结果 与模型组比较，治疗组小鼠肝组织NF-κB活性、血清IL-6和转氨酶水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，治疗组小鼠肝组织NF-κB活性、血清IL-6和转氨酶水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 二甲双胍能降低NASH小鼠肝组织NF-κB活性、血清IL-6和转氨酶水平。

NF-κB活性；白介素6；脂肪性肝炎；二甲双胍

脂肪性肝炎是脂肪肝向肝硬化发展的必然步骤，阻断和逆转脂肪性肝炎的发展对预防肝硬化具有重要意义。NF-κB是炎症反应的中心环节，在脂肪性肝病中起重要作用。不少研究[1-3]认为二甲双胍具有抗炎、防治脂肪肝的作用。也有研究[4]认为二甲双胍具有防止CCl4对小鼠肝毒性的作用。本文就二甲双胍对CCl4花生油溶液相关的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠肝组织NF-κB活性、血清白介素6(IL-6)及转氨酶水平的影响作一概述。

1 材料与方法

1.1 材料雄性昆明小鼠(由广东医学院动物中心提供)；CCl4(汕头市光华化学厂)；核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；凝胶迁移率变动分析(EMSA)试剂盒(Promega公司)；γ-32P-ATP(北京亚辉生物技术公司)；ELISA试剂盒(北京晶美生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组： 24只昆明小鼠随机分成3组，每组8只。对照组：正常饮食+皮下注射等量生理盐水；模型组：正常饮食+5% CCl4花生油溶液0.3 ml/10 g小鼠多点皮下注射，5 d/次。治疗组：造模的同时，灌胃给药盐酸二甲双胍200 mg·kg-1·d-1。于第8周断头处死各组小鼠，取肝组织检测NF-κB活性，取血检测IL-6和转氨酶水平。

1.2.2 EMSA法检测NF-κB活性：(1)提取及定量核蛋白；(2)探针标记纯化；(3)4%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制；(4)结合反应；(5)0.5×TBE电泳液，恒压180 V电泳90 min。剥离胶片，电灯烤干，磷屏曝光20 h。图像分析软件BandScan 5.0进行面积灰度分析，计算NF-κB活性值(灰度值)。

1.2.3 ELISA法检测小鼠血清IL-6水平：小鼠断头取血，全血标本室温放置20 min，于4 ℃离心机2 000×g离心20 min后取上清液。操作按ELISA试剂盒说明书进行，测定IL-6蛋白表达量(本实验用A值)。

1.2.4 检测经不同处理后各组小鼠的肝功能：各组小鼠断头取血后常温下放置20～30 min，4 ℃离心机3 000×g 离心20 min，上清即为所需血清。采用全自动生化仪测定血清ALT、AST。

2 结果

2.1 小鼠一般情况各组小鼠均存活，对照组小鼠体质量增加，鼠毛健康，安静，反应和活动良好。治疗组小鼠体质量较对照组增加,反应和活动尚可，毛发等情况明显比模型组好。模型组小鼠体质量增加明显,少部分小鼠鼠毛蓬乱，对刺激反应稍迟钝。

2.2 NF-кB DNA结合活性情况NF-κB DNA结合活性二甲双胍能抑制NF-κB活性，与模型组相比，治疗组小鼠肝组织NF-κB活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图1、表1)。

图1 不同处理组小鼠NF-κB活性情况 1：正常组; 2：模型组; 3：治疗组

2.3 二甲双胍对小鼠血清IL-6表达的影响二甲双胍治疗组小鼠血清IL-6浓度与对照组、模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.4 二甲双胍对小鼠转氨酶的影响二甲双胍能降低小鼠血清转氨酶水平，治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组与对照组小鼠ALT、AST水平比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 不同处理组小鼠转氨酶、血清IL-6水平和NF-κB活性比较±s)

注：与治疗组比较，*P<0.05。

3 讨论

脂肪性肝炎是脂肪肝进展为肝硬化不可避免的关键阶段，本实验发现脂肪性肝炎小鼠肝组织NF-κB活性显著增强。活化的NF-κB导致IL-6、TNF-α、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、生长因子-β1(TGF-β1)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)等下游致炎因子表达增加，而IL-6、TNF-α等炎症因子升高可反过来促使NF-κB活化，形成恶性循环，放大肝脏炎症损伤反应。肝细胞和Kupffer细胞等肝内细胞出现损伤并产生和释放炎症因子。肝星状细胞(HSC)活化并分泌大量细胞外基质，使肝脏原有结构被破坏，形成肝纤维化。阻断脂肪性肝炎的发生、发展对防治肝硬化具有重要意义。

脂肪细胞是IL-6的重要来源。高脂喂养的小鼠IL-6表达可显著升高[5]；有研究发现脂肪性肝炎患者血清IL-6水平显著升高，且与胰岛素抵抗程度呈正相关[6]。还有研究[7]发现IL-6水平与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)严重程度相关，在单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎及肝硬化的启动、发生和发展中起重要作用。IL-6可通过调控细胞因子信号抑制剂(SOCS-3、SOCS-1和SOCS-6)[8]、抑制IRS-1、GLUT4和PI3K的表达、抑制胰岛素依赖的AKT的激活等多种作用机制，促使胰岛素抵抗的发生。在脂肪肝的基础上，包括IL-6在内的细胞因子网络能刺激肝细胞产生炎性蛋白参与肝脏炎症应答，胰岛素抵抗时炎症敏感蛋白产生增多，进一步强化炎症反应过程，促进脂肪性肝病的发展。

二甲双胍是一种降糖药物，能通过多种途径起到保护肝脏的作用[9-10]；研究[1]发现二甲双胍通过对NF-κB活化的各个环节进行调控，进而起到调节炎症反应的作用。还发现高脂喂养的小鼠经二甲双胍治疗后IKK-α在肝和肾组织中的表达增加，NF-κB诱导激酶的表达显著降低。NF-κB活性下调能显著降低TGF-β1、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症介质和髓过氧化物酶的表达[2]。还有研究认为，通过抑制NF-κB的表达，包括TNF-α、IL-6和透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原也下降，ALT、AST等得到不同程度改善[3]。本实验发现，二甲双胍处理后小鼠的IL-6水平显著降低，其机制可能与抑制NF-κB活性相关。此外，还有研究发现，二甲双胍能分别增强或保持抗炎性细胞因子IL-4和IL-10的表达[12]。

本研究发现，二甲双胍治疗组小鼠ALT、AST水平较模型组显著降低。其机制可能与二甲双胍通过抑制NF-κB活性，减少炎症介质、细胞因子的产生，减轻小鼠的肝脏脂肪变性和炎症反应有关[1-3]。因此，二甲双胍可能具有潜在治疗脂肪性肝炎、保护肝脏的作用。NF-κB通路可能是二甲双胍保护肝脏的重要机制之一。本研究使用的二甲双胍药物用量大，应对临床用药安全进行深入研究，在以后的研究需进一步优化设计，如增加低剂量治疗组等。

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(责任编辑：王全楚)

The effect of the Metformin on NF-κB activity of the liver tissue, IL-6 and transaminase levels of the NASH mice

GUO Zhongqiu, SHI Zhizhou, LAI Kangbao, LIAO Qinghui, TAN Yaqin, CHEN Yuhua, LIU Ronghuo

Department of Endocrinology, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518172, China

Objective To observe the effect of the Metformin on NF-κB activity of the liver tissue, interleukin-6(IL-6) and transaminase levels of the nonalcoholic steatohepatitis (NASH) mice and to investigate the possible mechanism of Metformin prevention of NASH. Methods Twenty-four mice were divided into 3 groups randomly: normal group, model group and Metformin treatment group. Gel mobility shift assay (EMSA) was used to detect NF-κB activity of the liver tissue; the change of IL-6 was detected by ELISA; the level of the aminopherase was detected by automatic biochemical analyzer. Results The Metformin could reduced the NF-κB activity, IL-6 and aminopherase levels, compared with normal group and model group, there was significantly different (P<0.05). Conclusion Metformin can inhibit the NF-κB activity, IL-6 and aminapherase levels.

NF-κB activity; Interleukin-6; Steatohepatitis; Metformin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.024

郭中秋，硕士研究生，研究方向：内分泌代谢性疾病。E-mail：guozhongqiu2004@163.com

陈玉华，主任医师，研究方向：内分泌。E-mail：LRH99mymail@126.com

R575

A

1006-5709(2016)01-0087-03

2014-09-01