TLR4/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用*

蒋伟，张弦，周爱玲

TLR4/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用*

蒋伟1，张弦2，周爱玲3△

(1．南通大学科技与产业处，2．南通大学附属医院感染性疾病科，3．南通大学医学院病理生理学系，江苏南通226001)

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用及其机制，为神经退行性疾病(ND)的发病机制与防治研究提供新的实验依据。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元，免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元，以激活或阻断TLR4的作用。实验1设正常对照组、LPS组及TLR4抗体+LPS组;免疫荧光法检测P-P38，P-JNK的表达。实验2分为6组:正常对照组，LPS组，TLR4抗体+LPS组，SB202190(抑制P38)+LPS组，SP600125(抑制JNK)+LPS组，PD98059(抑制ERK)+LPS组;分别用TLR4抗体、P38、JNK及ERK的抑制剂预处理海马神经元后再给以LPS刺激24 h，Western blot法检测Bcl-2，Bax，Active-caspase-3的表达变化;流式细胞术检测海马神经元凋亡率。结果:LPS组海马神经元P-P38、P-JNK的表达明显高于正常对照组(P＜0．01)，TLR4抗体+LPS组P-P38，P-JNK表达显著低于LPS组(P＜0．01)。与正常对照组相比，LPS组海马神经元Bcl-2/Bax表达减少、Active-caspase-3表达增加，海马神经元凋亡率增加(P＜0．01)。而TLR4抗体+LPS组、SB202190+LPS组、SP600125+LPS组Bcl-2/Bax显著高于LPS组、Active caspase-3显著低于LPS组(P＜0．01)，海马神经元凋亡率显著低于LPS组(P＜0．05，P＜0．01)。PD98059+LPS组与LPS组海马神经元凋亡率无明显差异。结论:①海马神经元中有TLR4介导的P38/JNK信号通路。②海马神经元TLR4激活后，P-P38、P-JNK表达增加，使Bcl-2/Bax的比例降低和Active-caspase-3表达增加，从而促进海马神经元的凋亡。海马神经元凋亡过程中有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与。

海马神经元;TLR4/P38/JNK信号通路;Bcl-2/Bax;凋亡蛋白酶-3;细胞凋亡;脂多糖

神经退行性疾病(neurodegenerative disease，ND)是一类慢性、进行性神经系统疾病，神经细胞退行性病变是它们的共同特点。在大多数ND中，尤其是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)特征性病理变化之一是脑内神经元数目明显减少，以海马区和基底前脑受累最为严重，神经元减少平均可达47%。目前认为细胞凋亡(apoptosis)可能是引起AD神经元数目减少的重要原因［1，2］。

然而，在AD脑中为什么会引起神经元的凋亡?近年来发现的Toll样受体(Toll-like Receptors，TLRs)是一组新的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)。已知，在中枢神经系统(central nervous system，CNS)中，小胶质细胞、星形胶质细胞表达TLR1-9

［3］;最近Tang［4］等发现培养的皮层神经元表达TLR2和TLR4。近期本实验室的研究［5，6］和Walter［7］等均发现AD脑中TLR4表达增多，大鼠海马和皮层组织中能够表达TLR1-11，各种Toll样受体mRNA在正常未受干预的海马神经元上表达程度不同，海马神经元中TLR4高表达。

海马神经元中这些TLR4有何潜在意义?TLR4是人类发现的第1个TLR相关蛋白，主要识别革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。海马神经元凋亡过程中是否有TLR4介导的信号通路的参与?最近，Tang等［8］指出，培养的皮层神经元表达TLR2和TLR4参与了神经元凋亡。TLR4与其配体LPS结合后，能否通过P38/JNK信号通路调控海马神经细胞凋亡未见报道。

本项目采用大鼠海马神经元原代培养，利用不同的工具药，采用LPS作为TLR4的配体，TLR4抗体为阻断剂，运用MAPK通路选择性抑制剂SB202190 (抑制P38)，SP600125(抑制JNK)，PD98059(抑制ERK)预处理海马神经元，以减弱或加强TLR4信号转导通路的作用。运用免疫荧光、AnnexinV/PI、蛋白印迹等技术拟在细胞和分子水平，观察海马神经元凋亡相关蛋白，细胞凋亡率差异。探讨海马神经元凋亡过程中是否有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与，揭示海马神经元可以通过TLR4介导的信号通路引起其自身神经元的凋亡。

1 材料与方法

1．1材料

出生1 d内SPF级SD大鼠，由南通大学实验动物中心提供。许可证号:SYXK(苏)2012-0031。

DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(Gibco，USA); LPS、多聚赖氨酸(Sigma，USA);Trizol reagent(Invitrogen)，鼠抗GFAP单克隆antibody(Santa cruse，sc-166458);兔抗TLR4多克隆antibody，(Santa cruse，sc-10741);SB202190，SP600125，PD98059 (Enzo，编号分别为:EI-294-0001，EI-305-0010，EI-360-0005);NSE Antibody(Anbobio，C0280);JNK1 Antibody(Epitomics，3496-1);JNK1/JNK2/JNK3 Phospho Rabbit Monoclonal Antibody(Epitomics，2155-1);P38 MAPK Rabbit Monoclonal Antibody (Epitomics，1544-1);P38 MAPK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody(Epitomics，1229-1)。

MLS-3750高压蒸汽灭菌器(SANYO，日本); Milli-Q Reference系统(Millipore，美国);HQ-350 XT自动洗片机(苏州虎丘影像科技有限公司);SIMF140AY65型制冰机(SANYO，日本);各种型号的移液器(德国Eppendorf公司);细胞培养板(美国Corning公司);超净工作台(苏州华宏净化技术有限公司);细胞培养箱(法国Jouan公司);PMC-880迷你离心机(TOMY，日本)。

1．2海马神经元的原代培养及纯度鉴定

无菌操作下取新生1 d的SD乳鼠海马组织，放入预冷的无菌平衡盐溶液中(D-hanks液)，剔除血管、脑膜等结缔组织，平衡盐溶液冲洗，剪碎成1 mm3左右的组织块，0．125%胰蛋白酶吹打消化5 min左右，加入种植培养基(90%DMEM-F12，10%无支原体胎牛血清)终止消化5 min，200目钢筛过滤，1 000 r/min，离心10 min，弃上清后，加入种植培养基，制成细胞悬液，血细胞计数板计数，以1．0× 106cells/ml密度分别种植每孔中。置于37℃，5% CO2，95%湿度培养箱中培养，24 h后待细胞贴壁，全量换成饲养培养基(95%DMEM-F12，5%无支原体胎牛血清)，然后每孔加入2%体积的B27。每隔3 d换液1次。培养7 d后采用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和Hoechst 33342免疫荧光双标法，对培养的海马神经细胞进行纯度鉴定。

1．3实验设计

1．3．1免疫荧光化学染色观察P-P38，P-JNK的表达取培养7 d的海马神经元，分为control组、LPS (10 mg/ml)组、TLR4抗体+LPS组:TLR4抗体预处理2 h，加入LPS(10 mg/ml)刺激24 h，取出玻片进行免疫荧光化学染色，荧光显微镜(×200)下，观察拍片，(随机选取六个视野)，观察P-P38、P-JNK表达的阳性细胞数。

1．3．2 Western blot检测Bcl-2，Bax，Activecaspase-3的表达及流式细胞术检测海马神经元凋亡率实验分为6组:control组、LPS组、TLR4抗体+LPS组、SB202190(抑制P38)+LPS组、SP600125 (抑制JNK)+LPS组、PD98059(抑制ERK)+LPS组，分别用TLR4抗体、P38、JNK及ERK的抑制剂预处理海马神经元后2 h，再给以LPS刺激24 h;分别提取总蛋白，BCA法进行蛋白浓度定量，应用蛋白印迹法检测各组目的蛋白水平，用10%的SDSPAGE电泳P38，P-P38，JNK，P-JNK，12%的SDSPAGE电泳Bcl-2，Bax，β-Actin，Activited caspase-3，分离的蛋白用湿电转移法转到PVDF膜上，0．5%脱脂奶粉室温封闭1．5 h，TBST洗脱3次，抗体(P38，JNK稀释比例为1∶3 000;P-P38，P-JNK为1∶750; Bcl-2，Bax，Activited caspase 3为1∶500;β-Actin为1∶5 000)孵育，4℃过夜，再次TBST洗脱3次，然后用兔抗大鼠二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，再次TBST洗膜，然后使用ECL发光液于凝胶自动生成系统曝光，β-Actin为内参，重复试验3次，用Image J对蛋白灰度值进行计算，用Graph Pad Prism软件对数据进行统计学分析。

培养的海马神经元，PBS轻轻冲洗，按照凋亡试剂盒上的操作进行，Fluor 488 annexin V/PI双染，于流式细胞仪上检测。每组试验重复3次，用Graph Pad Prism软件对数据进行统计学分析。

1．4统计学方法

实验数据以均数±标准差(珋x±s)表示，应用SPSS11．5软件对两组资料进行t检验，多组资料进行方差分析;采用Sigma Pro 5软件对免疫荧光结果图像进行采集，GraphPad Prism 4软件作图分析。统计学方法采用ANOVA。

2 结果

2．1海马神经元的原代培养及纯度鉴定

原代培养的大鼠海马神经元，4 h后开始贴壁生长。24 h换液后继续培养，细胞开始有细小的突起长出。随着培养时间的延长，突起越来越长。至7～8 d细胞聚集生长，胞体呈圆形，有较好的折光性，数量多，生长旺盛。于倒置相差显微镜下观察见大量海马神经元铺满板底，并融合成单层(图1)。

Fig．1 The morphous of normal hippocampal neurons of rats (×40)

培养7 d的海马神经元进行细胞免疫荧光化学染色，对海马神经元的纯度进行鉴定。海马神经元被神经元特异性NSE标记的二抗染成红色，着色部分位于海马神经元的胞浆。用Hoechst将所有细胞的细胞核染成蓝色。经过观察多视野并先后拍摄同一视野下的红色荧光和蓝色荧光，然后将同一视野下的两张图片进行合并，统计所有视野中蓝色和红色同时着色的细胞数占所有细胞核着色的细胞数的比值，即可计算出海马神经元的纯度。经过计算，培养7～8 d的海马神经元纯度达到95%以上，满足实验的要求，可以用于进一步实验(图2)。

2．2免疫荧光法检测P-P38、P-JNK的表达

磷酸化的P38(P-P38)的被染成绿色，control组P-P38显著低于单一LPS组和TLR4抗体+LPS组(P＜0．01)，单一LPS刺激组P-P38表达量最多，明显高于control组和TLR4抗体+LPS组(P＜0．01，图3，表1)。control组P-JNK表达最少，control组PP38显著低于单一LPS组和TLR4抗体+LPS组(P＜0．01);TLR4抗体+LPS组表达次之，而单一LPS刺激组P-JNK表达量最多，明显高于control组和TLR4抗体+LPS组(P＜0．01，图4，表1)。

2．3Westernblot检测P-P38、P-JNK的蛋白表达

与正常对照组比较，LPS组Bcl-2/Bax表达降低，Active-caspase-3表达升高(P＜0．01);与LPS组比较，TLR4抗体+LPS组、LPS+SB202190和LPS +SP600125组Bcl-2/Bax均显著升高，Activecaspase-3明显降低(P＜0．01);而PD98059+LPS组与LPS组比较无明显统计学意义(图5、图6，表2)。

Fig．2 Identification of purity for hippocampal neurons(Immunofluorescence×400)

Fig．3 Changes of P-P38 positive cells of each group detected by immunofluorescence(×200)

Fig．4 Changes of P-JNK positive cells of each group detected by immunofluorescence(×200)

Fig．5 Bcl-2，Bax protein expression in the hippocampal neurons

2．4流式细胞术测定抑制TLR4/P38/JNK通路后海马神经元凋亡率

结果可见，图中左下象限为活细胞(LL)，左上象限为死细胞(UL)，右下象限为早期凋亡细胞(LR)，右上象限为晚期凋亡细胞(UR)。凋亡细胞总数为UR+LR之和。正常组海马神经元凋亡率较少，LPS组、PD98059+LPS组海马神经元凋亡率显著高于正常对照组(P＜0．01);TLR4抗体阻断组、SB202190+LPS及SP600125+LPS海马神经元凋亡率均显著低于LPS组;而PD98059+LPS组与LPS组比较无明显统计学意义(图7，表2)。

Fig．6 Active caspase-3 protein expressionin in the hippocampal neurons

Fig．7 Apoptotic rates of hippocampal neurons in different groups detected by flow ytometry

A:Control;B:LPS;C:TLR4 antibody+LPS;D: SB202190+LPS;E:SP600125+LPS;F:PD98059+ LPS;

LPS:Lipopolysaccharide

3 讨论

AD、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和帕金森综合征(Parkinson＇s syndrome，PD)均属神经退行性疾病，海马区和基底前脑等脑组织的神经元死亡变性是这些疾病的共同特征;而细胞的死亡主要是通过细胞的凋亡，近年来大量证据表明在神经退行性疾病如AD、ALS、PD等患者的脑组织标本中均有凋亡的生化标志物［9］。

海马组织是大脑边缘系统的重要组成部分，是学习、记忆等高级神经活动的重要部位。神经细胞退行性病变可以损伤海马组织甚至产生细胞凋亡或死亡。本实验以体外培养的大鼠海马神经元为研究对象，探讨海马神经元凋亡过程中是否有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与，揭示海马神经元可以通过TLR4介导的信号通路引起其自身神经细胞的凋亡。

Tab．1 Changes of P-P38 and P-JNK positive cells of each group detected by immunofluorescence(珋x±s，n=6)

Tab．2 The expressions of Bcl-2/Bax active-caspase-3 and apoptotic rates of hippocampal neurons in different groups(珋x±s，n=3)

3．1激活海马神经元TLR4引起凋亡率的增加

细胞凋亡是机体在内外环境因素的刺激下，启动自身机制，由基因调控的细胞死亡过程。但TLR4与其配体LPS结合后，能否引起海马神经元凋亡呢?施晓容等报道，单纯LPS诱导高热导致幼鼠海马神经元凋亡增多，LPS联合海人藻酸(KA)诱导幼鼠海马凋亡阳性细胞数明显增多［10］。本实验室近期研究发现，LPS可以诱导培养的新生大鼠海马神经元凋亡［11］。本研究结果显示，海马神经元TLR4的激活可引起海马神经元自身凋亡的增加。

3．2激活海马神经元TLR4对P-P38、p-JNK表达的影响

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路中主要有P38通路、c-Jim氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signalregulated protein kinases，ERK)通路;MAPK是公认与细胞增殖，分化及细胞凋亡关联的细胞内信号转导酶类［12］。

但海马神经元TLR4能否通过MAPK信号通路中的P38/JNK/ERK调控海马神经元的凋亡?p38已经被证实在PC12和小脑颗粒细胞［13］的凋亡调控过程中有着重要的作用。JNK信号通路被认为是一条导致细胞凋亡的重要通路，c-Jun的持续性表达和磷酸化为神经细胞凋亡所必需，Aβ诱导大鼠皮质神经细胞凋亡时，c-Jun的磷酸化水平呈时间依赖性升高。各应激反应中均有JNK通路激活，用特异性阻断剂阻断JNK通路，结果表现出抑制凋亡的保护效应，表明JNK通路是细胞应激反应诱导细胞凋亡的主要信号转导途径［14］。p38、JNK的磷酸化产物PP38、P-JNK标志着P38、JNK的激活，JNK及P38这两条通路的激活与应激时的多种病理生理及细胞凋亡过程有关。本研究结果表明，海马神经元TLR4激活后，引起P38、JNK磷酸化水平的升高，而TLR4抗体预处理能显著降低由LPS引起的P38、JNK的磷酸化的升高。

3．3TLR4/p38/JNK信号通路的激活能降低Bcl-2/Bax、增加Active-caspase-3表达

在MAPK信号转导途径中，ERK是最早被发现的而且是最具特征性的丝裂原活化蛋白激酶，认为其与细胞的增殖、转化和分化有关。JNK与P38通路参与和介导细胞凋亡。JNK信号转导途径具有多样性，其激活促进细胞凋亡的发生，调控凋亡相关基因的表达及激活半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族有关，Caspase家族是神经细胞凋亡的重要调节因子。活化的caspase-3有着核心地位，在凋亡过程中占据着主导地位，能够特异性的切割DNA，使参与DNA损伤修复的相关蛋白酶失活，导致细胞凋亡。

凋亡是受基因调控的，与凋亡相关的蛋白基因是Bcl-2家族，分为抗凋亡和促凋亡两类，Bcl-2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因［15］，二者的比例是决定细胞是否发生凋亡的重要调控因素。在体内Bcl-2可与Bax形成二聚体使Bax功能失活而抑制细胞凋亡，Bcl-2/Bax组成一个平衡体系，Bax增加则加速细胞凋亡，而Bcl-2过多则细胞凋亡被抑制，他们表达的蛋白在体内共同调节细胞凋亡。Bcl-2/ Bax的比值在中枢神经系统神经细胞凋亡中起关键作用。本研究结果表明，海马神经元TLR4/P38/ JNK信号通路激活后，使促凋亡蛋白Bax、Active caspase-3表达上调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调。

3．4TLR4/P38/JNK信号通路参与了海马神经元的凋亡

流式细胞仪定量分析结果可见，LPS组海马神经细胞凋亡率明显高于正常对照组;TLR4抗体组，SB202190组和SP600125组细胞凋亡率均低于单一LPS剌激组，PD98059+LPS组与LPS组细胞凋亡率无明显差异。结果显示，TLR4/P38/JNK信号通路参与了海马神经元的凋亡。

综上所述，LPS激活海马神经元TLR4后，P38和JNK磷酸化程度明显增强;Bcl-2/Bax表达降低，Active-caspase-3表达升高;海马神经元凋亡率增加。分别抑制海马神经元TLR4、P38、JNK后，能分别降低经LPS激活TLR4后的细胞凋亡率。海马神经元有TLR4/P38/JNK信号通路，该通路的激活能引起自身细胞的凋亡。

［1］Kayla M，Pate，Mc Call Rogers，et al．The Ability of Polyphenols to Reduce Aβ-Induced Apoptosis Associated with Alzheimer＇s Disease［J］．Biophysical Journal，2015，108(2):66a．

［2］McDonald JM，Cairns NJ，Taylor-Reinwald L，et al．The levels of water-soluble and triton-soluble Aβare increased in Alzheimer＇s disease brain［J］．Brain Res，2012，1450:138-147．

［3］Watson K，Fan GH．Macrophage inflammatory protein 2 inhibits beta-amyloidpeptide(1-42)-mediated hippocampal neuronal apoptosis through activation of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathways［J］．Molpharmacol，2005，67(3): 757-765．

［4］Tang SC，Arumugam TV，Xu X，et al．Pivotal role for neuronal Toll-like receptors in ischemic brain injury and functional deficits［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(34):13798-13803．

［5］Mao J，Hu Y，Zhou A，et al．Oxymatrine reduces neuroinflammation in ratbrain A signaling pathway［J］．Neural Regen Res，2012，7(30):2333-2339．

［6］Hu Y，Mao J，Zhang Y，et al．Role of Toll-like receptor 4 in inflammatory reactions of hippocampal neurons［J］．Neural Regen Res，2013，8(16):1465-1472．

［7］Walter S，Letiembre M，Liu Y，et al．Role of the Toll-Like Receptor 4 in Neuroinflammation in Alzheimer’s Disease［J］．Cell Physiol Biochem，2007，20(6):947-956．

［8］Tang SC，Lathia JD，Selvaraj PK，et al．Toll-like receptor-4 mediates neuronal apoptosis induced by amyloidβpeptide and the membrane lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal［J］．Exp Neurol，2008，213(1):114-121．

［9］Emerit J，Edeas M，Bricaire F．Neurodegenerative diseases and oxidative stress［J］．Biomed Phamracother，2004，58(1):39-46．

［10］施晓容，邵巧燕，刘俊红，等．脂多糖联合海人藻酸诱导的热性惊厥导致幼鼠海马神经元凋亡［J］．福建医科大学学报，2012，46(2):104-107．

［11］He Y，Zhou AL，Jiang W．Toll-like receptor 4-mediated signaling participates in apoptosis of hippocampal neurons［J］．Neural Regen Res，2013，8(29):2744-2753．

［12］Kim EK，Choi EJ．Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases［J］．Biochim Biophys Acta，2010，1802(4):396-405．

［13］Di Benedetto B，Kallnik M，Weisenhorn DM，et al．Activation of ERK/MAPK in the lateral amygdale of the mouse is required for acquisition of a fear-potentiated startle response［J］．Neuropsychopharmacol，2009，34 (2):356-366．

［14］Ramiro-Cortés Y，Morán J．Role of oxidative stress and JNK pathway in apoptotic death induced by potassium deprivation and staurosporine in cerebellar granule neurons［J］．Neurochem Int，2009，(5597):581-592．

［15］Reed JC．Double identity for proteins of the Bcl-2 family［J］．Nature，1997，38(6635):773-776．

The role of TLR4/P38/JNK signaling pathway in apoptosis of hippocampal neurons

JIANG Wei1，ZHANG Xian2，ZHOU Ai-Ling3△
(1．Science Technology and Industry Department，Nantong University，2．Department of Infectious Disease，Affiliated Hospital of Nantong University，3．Department of Pathophysiology，Medical College of Nantong University，Nantong 226001，China)

Objective:To investigate the effects of the Toll like receptor 4(TLR4)-P38-JNK signaling pathway in the apoptosis of hippocampal neurons in rats and its mechanisms．And to provide new experimental evidences for the pathogenesis research，prevention and treatment of neurodegenerative diseases(ND)．Methods:The hippocampal neurons derived from newborn rat were cultured for 7 d in vitro．The purity of hippocampal neurons was identified by immunofluorescence method．In order to activate or block the action of TLR4，the hippocampal neurons were pretreated with TLR4 ligand lipopolysaccharide(LPS)or TLR4 antibody．In the experiment1，the hippocampal neurons were divided into normal control group，LPS group and TLR4 antibody+LPS group．The expressions of P-P38 and P-JNK were deteced by immunofluorescence．In the experiment2，the hippocampal neurons were divided into 6 groups: normal control group，LPS group，TLR4 antibody+LPS group，SB202190(inhibitor P38)+LPS group，SP600125(inhibitor JNK)+ LPS group，PD98059(inhibitor ERK)+LPS group．The cells in above mentioned groups were pretreated with TLR4 antibody，the inhibitors of P38，JNK or ERK for 2 h respectively．Then，all the six groups were stimulated by LPS for 24 h．The expressions of Bcl-2，Bax and Active-caspase-3 were detected by Western blot．The hippocampal neuronal apoptosis rate were tested with flow cytometry．Results:The expressions of P-P38 and P-JNK of hippocampalneurons in LPS group were higher than those in normal control group(P＜0．01)．Compared with LPS group，the expressions of P-P38 and P-JNK were decreased significantly in TLR4 antibody+LPS group (P＜0．01)．Compared with the normal control group，the expressions of Bcl-2/Bax were decreased，while the expression of Activecaspase-3 was increased in the hippocampal neurons after LPS stimulation(P＜0．01)．The apoptotic rate of hippocampal neurons was higher in LPS group than that in the control group(P＜0．01)．Compared with LPS group，the expressions of Bcl-2/Bax were increasd and the expression of Active-caspase-3 was decreased in TLR4 antibody+LPS group，SB202190+LPS group，and SP600125+LPS group．The apoptotic rate of hippocampal neurons was significantly lower than that in the LPS group(P＜0．05，P＜0．01)．The cell apoptosis rate had no significantdifferences between PD98059+LPS group and LPS group．Conclusion:①TLR4-mediated P38/JNKsignaling pathway exists in hippocampal neurons．②After TLR4 activation in hippocampal neurons，the expressions of P-P38 and PJNK are up-regulated，the expressions of Bcl-2/Bax are decreased and the expression of Active-caspase-3 is increased，which promote apoptosis of hippocampal neurons．TLR4/P38/JNK signaling pathway is involved in apoptosis of hippocampal neurons．

hippocampal neurons;TLR4/P38/JNK pathway;Bcl-2/Bax;Active-caspase-3;cell apoptosis;lipopolysaccharides

R3

A

1000-6834(2016)06-571-06

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．019

南通市应用研究科技计划项目(BK2013007)资助

2015-09-23

2016-06-12

△【通讯作者】Tel:0513-85051732;E-mail:ALZ@ntu．edu．cn