高脂饲养青春期大鼠电击回避反应和海马CA3区场电位的改变*

王丹丹，王羽，汪镜静，陈颖，叶政，李晶，李敏，朱再满，潘群皖△

高脂饲养青春期大鼠电击回避反应和海马CA3区场电位的改变*

王丹丹1，王羽1，汪镜静1，陈颖1，叶政2，李晶2，李敏2，朱再满2，潘群皖2△

(1．皖南医学院临床医学院，2．生理教研室，安徽芜湖241000)

目的:观察高脂饲养至青春期的大鼠对电击回避反应和海马CA3区实时局部场电位变化。方法:断乳1周幼鼠改用基础饲料和高脂饲料分别喂养4周至青春期，分为基础饲料组(BF组)和高脂饲料组(HFD组)，Y型迷宫电击回避训练方法，记录2组大鼠电击回避达学会标准的相关参数，同时无线遥测大鼠达标时海马CA3区实时局部场电位。结果:与BF组大鼠比较，HFD组大鼠体重明显增加，Y型迷宫电击回避训练1～2 d大鼠达标百分率、电击回避达标各项指标均略优于BF组;双侧海马CA3区局部场电位节律出现去同步化快波改变，右侧海马CA3区出现了θ波和γ1波百分比的同步性增加，但无θ～γ1波相位-振幅耦合出现。结论:幼年期短期高脂饮食至青春期的大鼠，尽管体重较基础饲料大鼠增加，但未见Y型迷宫电击回避反应能力和海马依赖性空间认知功能的减退。

大鼠:青春期大鼠;电击回避训练;海马CA3区;局部场电位;

人类与年龄相关的空间认知功能衰退，是一个渐进性的生理过程，环境中一些有害应激物(stressor)的暴露，可加速人空间认知功能的衰退。高脂饮食(high fat diet，HFD)作为现代型应激物，可通过引起肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗和氧化应激等，加速年龄相关性脑老化，使学习记忆功能早衰，诱发空间认知功能的障碍［1］。新近的研究显示，经3个月HFD喂养的中年鼠和老年鼠，尽管其代谢出现紊乱和老年鼠年龄性空间认知能力减退，但高脂饮食并未引起中年和老年大鼠对新奇目标、新奇位置识别和Barnes迷宫空间辨别能力方面的损害［2］。利用八臂迷宫实验，Boitard等［3］使用食饵/无食饵配对双臂组合训练HFD幼鼠和中年鼠，观察两者在空间识别能力、关联性记忆和海马神经元的发育方面的改变，结果发现HFD幼鼠空间识别能力和关联性记忆柔韧性均较正常饮食组降低，海马神经元数量减少，相比之下，中年鼠无明显的改变。不少研究表明，HFD导致的学习记忆能力减退，易发生在动物的幼年期。幼年期大鼠HFD可引起海马依赖性空间技能，如长期记忆和逆转性学习功能减退，其原因可能与海马白细胞介素-1、α-肿瘤坏死因子等促炎性细胞因子过度表达，使海马产生轻微的慢性炎症有关，而这些变化在中年鼠并没产生［4］。幼年期HFD至青春期的大鼠，其应激反应能力有何变化?应激状态下与空间认知行为相关的海马实时电活动有何改变鲜见报道。本研究利用Y型迷宫电击回避训练方法，观察HFD青春期大鼠灯光-电击条件性回避训练的学习记忆能力，同时无线遥测海马CA3区局部场电位(local field potentials，LFPs)改变，综合探索行为状态下，HFD大鼠条件性回避反应和空间辨别能力的改变，分析高脂饮食对大鼠海马依赖性学习记忆和空间认知能力的影响。

1 材料与方法

1．1实验材料和仪器

MG-3型Y型迷宫刺激器(张家港市教学实验器械厂生产)，BW-200型生理无线遥测系统(成都泰盟科技有限公司生产)。大鼠基础(普通)饲料配方:谷物能量类(特级玉米、小麦、精米、燕麦、苜蓿草)占58%～64%动植物蛋白(秘鲁鱼粉、美国鸡肉粉、葵花、籽米百、豆米百)占33%～35%，动植物油脂(豆油、葵花籽油、猪油、鸭油)占2%～3%;高脂饲料配方:基础饲料占80%、加入13%猪油和7%全脂奶粉［5］，两种饲料配方所含成分见表1。

Tab．1 Formulation ingredients of basic and high fat feed(%)

1．2动物饲养和分组

清洁级雄性SD大鼠50只，常州市文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号:SCXK(苏)2011-0003。大鼠出生后哺乳2周的幼鼠断乳，第3周给予基础饲料适应性喂养1周达体重100 g左右，第4～8周将大鼠随机分为2组，即基础饲料(basic feed，BF)组和HFD组，其中BF组继续使用基础饲料饲养，HFD组改用高脂饲料饲养。自由进水进食，每日观察其活动度，每周大鼠称重1次。

1．3大鼠海马CA3区电极埋藏和局部场电位的记录［6］

不同饲料饲养4周后大鼠进入青春期(出生后第8周)，体重达300～360 g时，两组大鼠在脑立体定位仪下进行CA3区电极埋藏手术。左右海马CA3区定位［7］:前囟-2．4 mm，矢状缝旁开1．0 mm，深度3．8 mm。术后恒温饲养7 d以上，连续3 d肌注青霉素(40 U/kg)预防感染。CA3区电极插入准确性采用苏木精局部注射，快速冷冻切片镜下定位观察，或实验结束后活组织HE染色电极插痕检查。

电极埋置后饲养7 d以上成活的大鼠，分别在迷宫电击回避实验前、达标后记录海马CA3区实时LFPs。无线遥测使用外置式发射子，强磁打开发射子开关后，发射子输入端分别接地电极和左、右侧埋藏电极。发射子所采集的左、右侧CA3区LFPs信号，通过发射由智能接收机解码，经网络中心机输送至电脑，利用系统配套软件记录和分析遥测LFPs。遥测参数设置为:采样率500 Hz，低通滤波截止频率0．1 Hz，高通滤波截止频率100 Hz。

1．4大鼠Y型迷宫电击回避实验

Y型迷宫电击回避实验分为测试期和训练期［6］。以Y型迷宫随机不休息法进行测试。将大鼠置于Y型迷宫中，以所在支臂为起点通电(60 V)，大鼠受电击逃窜至安全区即亮灯区，灯光继续作用10 s，为一次测试。随后以大鼠所在支臂为下次测试起点，重复以上操作。足底通电10 s内一次跑向安全区则为正确反应。每天测试20次，连续10次测试中有9次或以上为正确反应，判定大鼠已达学会标准，未学会者第2天继续上述训练，直至第4天，第4天仍未学会的大鼠被剔除。本研究剔除＞4天未达标、电极定位不准确的大鼠，最终筛选出BF组大鼠20只，HFD组大鼠20只。大鼠训练前和达标即刻，均在其所处臂内实时遥测其CA3区LFPs。

1．5电击回避反应达标观察指标［8］

为评定各组大鼠电击回避反应能力及空间认知能力的优劣，测量以下指标并对其进行统计比较:达标所需的天数(days to reach the standard，DRS):达标所需的训练次数(training number，TN)、正确反应率(correct response rate，CRR)、主动回避率(active avoidance rate，AAR)、错误反应次数(error reaction number，ERN)。

1．6统计学处理

LFPs各节律提取和分析使用快速傅里叶变化，或将LFPs信号以txt文件输出，通过MATLAB软件小波包处理。采用MATLAB算法对其高、低频部分做二元分解，按层推进，分解信号带宽为Fs/2n+1，当分解频带数目为29个时，带宽近似为0．5 Hz，以此重构LFPs信号。为防止信号混叠，输出信号的最大检测频率设为250 Hz［9］。所有实验所获数据以均数±标准差(珋x±s)表示，采用SPSS 16．0软件统计处理，Levene法检验方差齐性，两独立样本比较用t检验，不满足检验条件时，采用秩检验。

2 结果

2．1不同饲料喂养大鼠体重的变化

结果表明，4～7周HFD大鼠体重较BF组大鼠体重有增强趋势，第8周HFD组大鼠体重平均达360 g，BF组为318 g，HFD组大鼠体重较BF组显著增加(P＜0．05，图1)。

Fig．1 Comparison of weight changes between the two groups of rats in 4～8 weeks(珋x±s，n=20)*P＜0．05 vs basic feed group

2．22组大鼠Y型迷宫电击回避训练达标情况

按照电击训练学会标准，计数2组大鼠每天学会数量，除以每组大鼠总数(20只)，计算出每天大鼠达标百分率(图2)。两组大鼠达标率曲线高峰处均位于训练的第2天，HFD组大鼠3 d内达标率曲线下面积明显大于BF组，1～2 d达标率达79%，高于BF组70%的达标率。

Fig．2 Percentage of two groups of rats reaching the standard in different training days(n=20)

2．32组大鼠电击回避训练达标参数的比较

根据大鼠电击回避反应训练达标的指标，判断各组大鼠电击回避学习记忆能力和空间认知能力。HFD组大鼠各项指标绝对值均略优于BF组，但各项指标均未见统计学差异，表明HFD组与BF组的电击回避反应和空间认知能力无明显改变(表2)。

Tab．2 Parameters of reaching the standard from two groups of rats in electric shock avoidance training(珋x±s，n=20)

2．4大鼠海马CA3区电极插入定位

大鼠海马CA3区埋藏电极的定位检查使用HE染色，海马切片镜下可观察到CA3区电极插痕，表明立体定位及电极插入部位准确(图3)

2．5电击回避训练达标前后海马CA3区LFPs的比较

Fig．3 Stereo positioning of rat hippocampus CA3 Left:Stereotaxic map;Right:The trajectory(arrow indicate)of the electrodes inserted into right CA3 region

首先在Y型迷宫内记录训练前2组大鼠海马CA3区LFPs，然后分别进行电击回避实验，大鼠一旦训练达标，随即在其所在迷宫臂内遥测CA3区实时LFPs。然后，使用快速傅里叶变换或MATLAB软件小波包提取法提取出LFPs中的各节律，其中包括δ波(0．5～4 Hz)、θ波(4～8 Hz)、α波(8～13 Hz)、β波(13～30 Hz)、γ1波(30～40 Hz)、γ2波(40～50 Hz)、γ3波(50～60 Hz)、γ4波(60～70 Hz)、γ5波(70～80 Hz)、γ6波(80～90 Hz)、γ7波(90～100 Hz)，图4显示BF组一只大鼠海马CA3区原始LFPs及其小波包提取的各节律。

将HFD组大鼠海马CA3区LFPs各节律与BF组进行比较，电击回避训练前两组LFPs节律未见统计学意义差异，但训练达标后实时LFPs可见HFD组大鼠左侧海马CA3区α、β波百分比较BF组显著增加(P＜0．01)，δ波百分比代偿性降低(P＜0．01);右侧海马CA3区θ和γ1波百分比明显高于BF组(P＜0．01)，δ波代偿性降低(P＜0．01，图5)。

Fig．4 Thedifferentrhythmof LFPsabstractedbywavelet packet in hippocampal CA3 region of BF group a rat LFPs:Local field potentials;BF:Basic feed

Fig．5 The analysis of LFPs rhythm recorded on hippocampal CA3 region from two groups of rats(珋x±s，n=20) A:Left CA3 region;B:Right CA3 region LFPs:Local field potentials＊＊P＜0．01 vs basic feed group

2．6HFD组大鼠右侧海马CA3区θ和γ1相位-振幅耦合的小波包分析

HFD组大鼠右侧海马CA3区θ和γ1节律百分比较BF组显著增加，该两节律是否存在频率交错耦合(cross-frequency coupling，BFC)神经振荡(neural oscillations)现象［10］?为此，使用小波包相位-振幅耦合(phase-amplitude coupling，PAC)分析方法，对两组大鼠右侧海马CA3区θ和γ1节律采用希伯尔特变换(Hilbert transform)方法，提取θ节律信号的相位值φfp(t)和γ1节律包络信号的强度值AfA (t)，构建时间序列的矩阵［φfp(t)，AfA(t)］，以10 °为相位组距，将一个θ节律振荡周期分为36等份，每一等分为j，计算每一等份γ1平均强度。按照Canolty算法［11］，若＜AfA(t)＞φfp(j)为j位相所对应的γ1波信号的平均强度，则可计算其熵值(H):

其中N=36，Pj为:

利用H值可评估γ1波振幅的变化是否与θ波位相之间存在着一致性，这种一致性可用相位-振幅调制指数(Modulation Index，MI)衡量，MI=Hmax-H/Hmax，MI值越高，γ1波振幅随着θ波某一位相明显增高表现出波动性，相反，MI值越小，γ1波振幅随θ波位相波动较小。MI值计算结果显示，HFD组大鼠电击回避训练后，右侧海马CA3区θ～γ1波 PAC的平均MI值为0．00206±0．00085，与训练前MI值0．00187±0．0005比较，或与训练后BF组MI值0．00173±0．00045比较，均未见统计学意义的显著差异。HFD组和BF组大鼠训练后右侧海马在θ波周期中(0-7200)，γ1波振幅改变波动均较小，表明无θ～γ1波PAC出现(图6)。

Fig．6 PAC analysis ofθandγ1 rhythms recorded on right hippocampal CA3 region(珋x±s，n=20) A:BF group;B:HFD group;PAC:Phase-amplitude coupling;BF:Basic feed;HFD:High fat diet

3 讨论

HFD对人类中枢神经系统的直接损害以及引起相应的行为学功能衰退，当今尚无定论。尽管长期HFD可通过肥胖、高脂血症、糖尿病和代谢紊乱等导致人空间认知能力减退，但这种能力的减退是否与HFD对海马神经元电生理功能的直接损伤有关，仍是一个值得研究的问题。大鼠Y型迷宫电击回避实验，主要是测定动物电击(应激)回避反应和光照空间(安全区)条件性认知能力的一种行为学研究方法，它与海马的学习记忆功能密切相关。

啮齿类动物出生后60 d左右，即进入青春期(adolescence)［12］。本研究结果提示，幼年期HFD至青春期的大鼠，与BF组大鼠比较，虽然出现了HFD所导致的肥胖倾向，但在电击状态下，其1～2 d内大鼠达标率较BF组为高，各指标所反映的应激能力和空间认知能力未出现明显的障碍，且某种意义上还略优于BF组大鼠。上述发现似乎与有关报道［3，4］不相一致，分析其原因:其一可能是本实验幼鼠HFD短期暴露，尚不足以引起实验阶段青春期大鼠海马形成炎性和氧化应激损害，导致海马性空间认知的减退;其二是大鼠Y型迷宫电击回避实验达标的过程，本身就包括对大鼠的刺激训练。根据有关报道，使用HFD喂养16周的大鼠，在电击状态下，通过旋转轮或卧在踏板上逃脱的技能和海马性空间记忆能力减退，但给予上述逃脱方法反复训练7次后，HFD大鼠逃脱技能和海马性空间记忆指标逆转至正常，训练本身可增加海马CA3区脑源性神经营养因子的分泌，降低HFD导致的海马性记忆的衰退［13］。Beilharz等［14］研究表明，大鼠短期暴露高脂加高糖，或单纯高糖饮食环境，可导致海马依赖性空间认知功能的减退，但对目标的识别未出现障碍。对比单纯高糖饮食导致大鼠海马所产生的变化，发现这种海马依赖性空间认知的损害，可能与高糖饮食导致海马产生炎性改变和氧化应激有关，因为海马性空间认知减退，出现在HFD引起的肥胖和高胰岛素血症之前。

大鼠Y型迷宫电击回避训练中安全区的识别，与海马性空间认知能力密切相关。本研究在观察大鼠迷宫行为变化的同时，同步遥测了两组大鼠海马CA3区实时LFPs。对LFPs的分析结果表明，HFD组大鼠左侧海马CA3区α、β波百分比较BF组显著增加;右侧海马CA3区θ和γ1波百分比明显高于BF组，双侧δ波代偿性降低，提示HFD组大鼠经电击回避训练后，海马CA3区神经元电活动出现了去同步化现象，神经元活动较BF组大鼠增强，结合HFD组大鼠1～2 d内电击回避达标率较高和达标参数略优于BF组的实验结果，可以认为HFD组大鼠海马CA3区神经电活动的去同步化，可能与大鼠Y型迷宫电击回避和条件性空间认知能力保持正常行为状态有关。

本课题组先前的研究发现，与普通回避反应大鼠比较，Y型迷宫电击回避实验中快回避反应大鼠右侧海马CA3区出现了明显的θ和γ1节律增强，提示右侧海马在条件性回避反应和空间认知方面占优势作用［6］。在空间认知行为的执行方面，左、右侧海马具有不对称性，其中右侧海马在以环境(场景、地形)为导向抵达目标中占优势，而左侧海马靠通过事件记忆(episodic memory)，按照已知的路径程序抵达目标［15，16］。本研究中HFD组大鼠右侧海马CA3区θ和γ1百分比较BF组显著增加，是否表明该区域产生了θ～γ1 PAC现象?这种θ～γ交错耦合，易触发海马的长时程增强，改变突触的可塑性，增强大鼠空间认知的学习和记忆能力［17，18］。为此，我们使用了小波包PAC分析方法，对右侧海马CA3区θ波相位和γ1波振幅做了交错耦合分析，发现HFD组和BF组大鼠训练后右侧海马在一个θ波周期中，γ1波振幅改变波动均较小，不存在θ～γ1波PAC，即未出现使大鼠空间认知能力增强的θ～γ1神经信息流。

综上所述，本研究的意义在于通过大鼠迷宫电击回避实验和海马CA3区实时场电位的综合分析，证实了幼年期HFD饲养大鼠，其迷宫电击回避反应和海马性空间认知能力未出现损害，这为幼年期HFD饮食是否影响海马性学习记忆功能提供了一个方面的佐证。

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The changes of electric shock avoidance response and local field potentials on hippocampal CA3 region of the adolescent rats with high fat feeding

WANG Dan-dan1，WANG Yu1，WANG Jing-jing1，CHEN Ying1，YE Zheng2，LI Jing2，LI Min2，ZHU Zai-man2，PAN Qun-wan2△
(1．Clinical Medical College，2．Departenment of Physiology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China)

Objective:To investigate the changes of shock avoidance response in Y maze and the real-time local field potentials (LFPs)on hippocampal CA3 region in adolescent rats with high fat feeding．Methods:The juvenile rats of weaning 1 week were fed separately on basic feed(BF)and high fat diet(HFD)for 4 weeks until the puberty．Using the electric shock avoidance training method，the relevant parameters of reaching the learning standard of two groups of rats were recorded，and the LFPs of CA3 region in hippocampus were explored simultaneously by wireless telemetry．Results:Compared with the BF group，the body weight of HFD rats were increased significantly(P＜0．05)，the rats percentage of reaching the learning standard within 1 to 2 days and the various parameters ofshock avoidance recorded in training were allsuperior to those of BF group rat，the LFP rhythm of bilateralhippocampal CA3 region appeared to the desynchronizd fast wave．Theθandγ1 rhythms of right hippocampal CA3 region shown synchronous increase，but there was no coupling formation in phase-amplitude of theθandγ1 rhythms．Conclusion:From juvenile to adolescent with HFD intake，the adolescent rat gained an increase significantly in weight，but the ability of shock avoidance and the function of hippocampusdependent spatial cognition in Y maze had not be expected decline．

rat;adolescent rat;electric shock avoidance training;hippocampal CA3 region;local field potentials

R338．2

A

1000-6834(2016)06-545-06

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．013

国家级大学生创新创业训练计划(201410368006);安徽省高校自然科学基金重点项目(KJ2016A720)

2016-01-04

2016-07-04

△【通讯作者】Tel:0553-3932473;E-mail:panqunw@163．com