香菇液体菌种深层培养工艺研究

刘世玲　唐　悦　尚东妮　江　坤　曹现涛　李克彬　田少平（. 宜昌市农业科学研究院，湖北 宜昌 443000；. 湖北五林中地农业科技有限公司，湖北 宜昌 443000）

张文斌2　李文德2　王治江1*　王少秋1（1. 河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2. 甘肃省张掖市经济作物推广站，甘肃 张掖 734000）



香菇液体菌种深层培养工艺研究

刘世玲1唐悦2尚东妮2江坤2曹现涛2李克彬1田少平2*
（1. 宜昌市农业科学研究院，湖北 宜昌 443000；2. 湖北五林中地农业科技有限公司，湖北 宜昌 443000）

摘要目的：在香菇液体菌种培养基筛选、50 L培养罐及500 L培养罐工艺试验的基础上，探索10 m³培养罐培养工艺。试验结果：培养液3 h溶氧开始下降，4 h pH开始降低，102 h菌丝球固形物体积达67.7%。结论：运用500 L培养罐作为种子罐，可显著缩短香菇菌丝在培养罐中的适应时间；香菇液体菌种深层培养在24 ℃，溶氧90%～98%，搅拌速率120 rpm条件下比较适宜；最佳接种时间为80～130 h，接种量为每个接种孔10 mL。关键词香菇； 液体菌种； 培养； 工艺

据统计，目前我国的香菇产量约占世界香菇总产量的70%，香菇产业关系到国家食用菌产业的整体水平。目前香菇的种植主要依靠固体菌种，而固体菌种具有成本高、生长周期长、接种效率低等缺点。随着科技的进步，食用菌生产方式由家庭作坊式操作、季节性生产的模式向设施化、工厂化、周年化、规模化生产模式转变，采用液体深层培养工艺制备食用菌菌种已成为研发热点[2]。金针菇、杏鲍菇等在工厂化生产中已运用液体菌种[3～4]。液体菌种具有生长周期短、菌丝生长快、多点萌发、出菇整齐等优势[5]。目前香菇液体菌种的研究多停留在实验室摇瓶和中小型培养罐中培养的阶段[6～8]，尚未在实际生产中大规模应用。本研究在前期培养基筛选、摇瓶培养、50 L培养罐及500 L培养罐培养的基础上，采用10 m³培养罐深层培养香菇液体菌种，对培养过程全程监控，并进行接种试验，以期获得可运用于实际生产的香菇液体菌种培养工艺。

1　材料和方法

1.1材料

（1）香菇菌种808A。

（2）主要仪器和设备。超净工作台，恒温振荡培养箱，高压蒸汽灭菌锅，电子天平，无菌培养接种罐，5 mL移液枪，500 L培养罐，10 m³培养罐。

（3）培养基。菌种活化培养基为PDA培养基。种子及培养罐培养基相同，配方为糖蜜1%，豆粕粉0.3%，玉米粉0.3%，KH2PO40.05%，MgSO40.03%，另在培养罐中添加消泡。PDA培养基和种子培养基于121 ℃下灭菌。

1.2方法

（1）供试菌种活化。在无菌条件下将母种菌丝接种至PDA斜面上，24 ℃下培养7天后挑选菌丝浓密、洁白、健壮的试管作为供试菌株。

（2）液体菌种的制备。将2块1 cm3的菌丝块接种至含100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，24 ℃摇床培养，转速160 rpm。6天后扩大培养，即将液体菌种转接至装有2 L培养基的5 L三角瓶中，接种量为5%，培养方法与上述相同。5天后运用无菌培养接种罐接种到500 L培养罐培养，接种量为2%，4天后得到种子。

（3）培养罐灭菌。培养罐及配套设备进行空消，时间1 h，温度121 ℃，压力0.1～0.15 MPa；配料后（装料系数为70%，初始pH调至5.0）培养原料液和培养罐进行实消，时间1 h，温度121 ℃，压力0.1～0.15 MPa；流加罐实消，时间1 h，温度121 ℃，压力0.1～0.15 MPa。

（4）接种。实消后，培养液温度冷却到24～25 ℃时接种，将种子液接入10 m³培养罐，接种量为5%。

（5）参数控制及培养过程中的检测要求。培养基初始pH调为5.0；整个培养过程中温度设定为24 ℃，压力0.13 MPa；整个培养过程中要求溶氧量为90%～98%之间（通过调节转速与空气流量实现）；搅拌转速：前60 h，100～140 rpm；后期60～120 h，150 rpm（视溶氧值和菌丝球直径大小进行调整）；进风量100～250 L/min（根据溶氧值调整）；前24 h，取两次样，取样要求检测菌浓（菌体浓度）和离线pH值，同时镜检香菇菌丝形态并检测是否染杂。25～120 h每隔6 h取一次样，取样要求检测总菌浓和离线pH值，同时镜检香菇菌丝形态并检测是否染杂；整个培养过程中要求每小时记录一次在线pH、通风量、溶氧、温度、碱加入量等数据。

（6）菌丝萌发试验。香菇菌丝体培养进行到第4天、第5天和第6天时，分别取样接种至栽培袋中。栽培料配方为木屑68%、棉籽壳10%、麸皮20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%左右，栽培袋大小15×30（cm）。灭菌冷却后无菌条件下用打孔器在栽培袋侧面打1个孔，大小为1.0×1.0×10.0（cm），用移液枪在侧面及袋口接种，接种量为每孔10 mL。接种后用胶带及时封住接种口，每天接60袋，置于24 ℃环境下暗培养，观察菌丝萌发情况。

2　结果与分析

2.10.5 m³种子罐

（1）pH的变化。培养的前30 h pH变化缓慢，由4.97降低至4.89，表明这一阶段香菇菌丝处在适应期，代谢缓慢；至59 h pH下降到4.44；79 h至100 h之间pH下降较快，表明期间菌丝体大量增多，代谢活跃，产生大量酸性物质。这个阶段应该是菌丝生长的对数期至稳定期。

（2）溶氧的变化。在菌丝培养进行65 h后溶氧开始降低，88 h后溶氧量恢复至初始值。此期间通过增加搅拌转速（最高150 rpm）和增大通风量（阀门开量由10%增至12%）来保持培养基中的溶氧量，以保证菌丝体生长代谢所需要的氧气。这期间菌丝代谢旺盛，需要消耗大量的氧气，而造成培养基中溶氧量明显下降。溶氧开始下降的时间点（65 h）与开始流加碱的时间点（59 h）较一致，同样标志香菇菌丝体大量繁殖，菌丝此时处于对数生长期。

（3）菌丝球固形物体积的变化。由于培养基中有难以分解的豆粕粉颗粒等固体物质，通过检测培养基中菌丝球的干重或湿重难以真实反映菌丝体的生物量。本研究通过检测取样样品中培养固形物（主要是香菇菌丝体）的体积占样品总体积的百分数用以反映生成的香菇菌丝体的量。具体方法为每隔6 h取样一次，将样品混匀后取100 mL倒入100 mL量筒中，静置2 h后等固形物体积不再减少，记录固形物的体积，并计算固形物的百分比。

由图1可知，香菇菌丝体的量在30 h之前很少，无法统计，36 h开始明显增多，达12.4%，此时菌丝体处于对数生长期。66 h至96 h间固形物体积增长很快，由24%增至70%，平均每小时的增加量达1.53%，96 h固形物的体积比达到70%。

图1　0.5 m³种子罐内的固形物的体积比与培养时间的关系

（4）菌丝形态的变化。正常的香菇双核菌丝体细长，壁光滑，隔膜不明显，隔膜之间的间距较大，且有明显的锁状联合，可作为区分香菇菌丝体和其他杂菌的一个重要的标志。在培养过程中取样检测发现4天之前香菇菌丝检测形态正常，分节少，壁光滑，有明显的锁状联合标志。

2.210 m3培养罐

（1）pH的变化。培养前12 h pH变化缓慢，由4.63下降至4.55，表明这一阶段香菇菌丝处在适应期；48 h至96 h之间pH下降较快，表明期间菌丝体大量增多，代谢活跃，产生大量酸性物质，应该是菌丝生长的对数期至稳定期。

（2）溶氧的变化。溶氧在菌丝培养进行3 h后开始降低，33 h后溶氧量保持在100%不变。此期间通过增加搅拌转速（最高150 rpm）来保持培养基中的溶氧量，以保证菌丝体生长代谢所需要的氧气。溶氧开始下降的时间点（3 h）与pH开始降低的时间点（4 h）较一致，同样标志香菇菌丝体逐渐开始繁殖。

（3）菌丝球固形物体积的变化。由于培养基中有难以分解的豆粕粉颗粒等固体物质，通过检测培养基中菌丝球的干重或湿重难以真实反映菌丝体的生物量。本研究通过检测取样样品中发酵液固形物（主要是香菇菌丝体）的体积占样品总体积的百分数来反映生成的香菇菌丝体的量。具体方法为每隔6 h取样一次，将样品混匀后取100 mL倒入100 mL量筒中，静置2 h后等固形物体积不再减少，记录固形物的体积，并计算固形物的百分比。

从图2看，香菇菌丝体的量12 h之前很少，无法统计，24 h开始明显增多，达15%，此时菌丝体处于对数生长期，相对于pH和溶氧量，这个指标反映的香菇菌丝的生长时期较滞后，因为只有菌丝体累积到一定量时才能反映出来。24 h 至48 h之间固形物体积增长很快，由17.3%增至42.8%，平均每小时的增加量达1.06%，102 h固形物体积比达到67.7%，此后不再增加，反而开始减少，这可能是因菌丝体开始自溶造成的。

（4）菌丝形态的变化。在培养过程中，取样检测发现香菇菌丝检测形态正常，菌丝分节少，壁光滑，有明显的锁状联合标志，未感染杂菌。

图2　10 m³培养罐内的固形物体积比与培养时间的关系

（5）菌丝在栽培袋中的萌发情况。在香菇菌丝体深层培养96 h、120 h、144 h时分别取样10 mL接种至栽培袋的顶部和侧面。接种3天后可以观察到香菇菌丝开始萌发，10天后菌丝吃料直径约25 cm，顶部接种菌丝完全覆盖料面并沿侧面延伸约4 cm。重复3次接种，菌丝生长无明显差异。

3　讨　论

食用菌液体菌种深层培养，一个重要问题是防止污染，一旦液体菌种被细菌或真菌污染，整个培养罐的菌种都将被丢弃，经济损失惨重。

通气量、搅拌速率、温度和pH是影响香菇液体菌种培养的重要因素。其中控制通气量和搅拌速率是为调节溶氧和菌丝球大小。在菌丝生长的对数期，有大量菌丝体生成，代谢旺盛，对氧气的消耗多，此时要适当增加通风量和搅拌速率。试验中发现若搅拌速率过快（150 rpm）会导致菌丝球过小。结合观测溶氧、pH及菌丝体生成量，可以推测菌丝培养处于哪一阶段。

香菇菌丝液体培养时间和接种量对液体菌种在栽培袋中的萌发至关重要。在研究中发现香菇菌丝体深层培养4天、5天、6天时，分别接种，10天后菌丝体生长无明显差异，且生长状况良好，说明这期间均适合接种，至于后续表现是否有差异，仍待进一步观测。

参考文献

[1] Kirk P., Minter D.S.. Dictionary of the Fungi(tenth edition)[M]. CABI Europe-UK, 2008.

[2] 黄传华. 平菇与鸡腿蘑液体菌种培养及应用技术研究[D]. 泰安: 山东农业大学园艺科学与工程学院, 2006.

[3] 王桂金. 金针菇工厂化生产液体菌种制作工艺研究[J].食用菌, 2007, 29(2): 16-17.

[4] 沈敏, 李文生, 周雷. 杏鲍菇液体菌种研制与工厂化栽培应用[J]. 中国农技推广, 2011, 27(6): 14-15.

[5] 缪学翔. 食用菌液体菌种生产优势、特性和效益初探[J].杭州农业科技, 2003 (3): 18-19.

[6] 沈维铎, 姚志伟, 杨群. 香菇液体培养的工艺优化[J].武汉生物工程学院学报, 2012 (2).

[7] 林翔鹰, 党俊梅, 马凯峰, 等. 香菇液体菌种深层发酵的研究[J]. 食用菌, 2006, 28(1): 14-16.

[8] 秦秀丽. 香菇液体培养的工艺研究[J]. 北方园艺, 2009(6): 227-229.

【说明】2016年第1期P43-47发表的“真姬菇液体培养特性及胞外酶的活性研究”，文章的作者单位，按原稿为：

张文斌2李文德2王治江1*王少秋1
（1. 河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2. 甘肃省张掖市经济作物推广站，甘肃 张掖 734000）

特此说明。

Research on submerged culture technology of liquid spawn of Lentinula edodes

Liu Shiling1Tang Yue2Shang Dongni2Jiang Kun2Cao Xiantao2Li Kebin1Tian Shaoping2

（1. YiChang Academy of Agricultural Sciences, Yichang Hubei 443000；
2. HuBei WuLin Land Agricultural Science & Technology CO., LTD, Yichang Hubei 443000）

AbstractObjective: Research the submerged culture technology of liquid spawn of Lentinula edodes with 10 m³ volume fermenter based on the media and technology of 50 L and 500 L volume fermenters. Results: pH began to decline at 4 hours after inoculating; dissolved oxygen tension began to decline at 3 hours after inoculating; the volume ratio of mycelia reached 67.7% at 102 hours after inoculating. Conclusions: The risk of contamination could be reduced effectively by inoculating with sterile culture and 500 L volume fermenter which has been patented ; the proper condition for submerged culture of L.edodes spawn was 24 ℃, dissolved oxygen tension between 90%～98%, agitation speed 120 rpm; the optical inoculating period was 96～144 hours, inoculation volume was 10 mL.

Key wordsLentinula edodes; liquid spawn; culture; technology

中图分类号：S646

文献标识码：B

文章编号：2095-0934（2016）02-100-04

作者简介：刘世玲（1966—），女，正高职高级工程师，主要从事应用微生物学方面的研究工作。E-mail：lling.s@163.com*通讯作者：田少平（1979—），男，高级园艺师，主要研究方向为食用菌栽培育种及产业化。E-mail：wh201206@126.com