高效液相色谱法同时测定山柰中槲皮素和山柰素含量

封传华 李刚 张静 徐兰 陶晓璇

摘要：目的 建立高效液相色谱法测定山柰药材中槲皮素和山柰素的含量。方法 采用ODS2 C18（5 μm， 4.6 mm×150 mm）色谱柱，以甲醇-0.4%磷酸（47∶53）为流动相，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为367 nm，进样量为10 μL。结果 槲皮素在0.016 5～1.65 μg范围内呈现良好的线性关系（r=0.999 7），平均回收率为96.8%，RSD=2.02%；山柰素在0.014 6～1.46 μg范围内呈现良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为97.3%，RSD=1.77%。结论 该方法操作简单、结果准确、重复性较好，可用于山柰药材中槲皮素和山柰素的含量测定。

关键词：高效液相色谱法；山柰；槲皮素；山柰素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.020

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0077-03

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Kaempferia galanga L.. Methods ODS2 C18 （5 μm， 4.6 mm×150 mm） was used as chromatographic column； methanol-0.4% phosphate （47：53） was the mobile phase； the flow rate was 1 mL/min； column temperature was 30 ℃； the detection wavelength was 367 nm； the injection volume was 10 μL. Results Quercetin showed good linear relationship in the range of 0.016 5–1.65 μg （r=0.999 7）. The average recovery rate was 96.8%， RSD=2.02%； kaempferol showed good linear relationship in the range of 0.014 6–1.46 μg （r=0.999 5）. The average recovery rate was 97.3%， RSD=1.77%. Conclusion The method is simple， accurate， and with good reproducibility， which can be used for content determination of quercetin and kaempferol in Kaempferia galanga L..

Key words： HPLC； Kaempferia galanga L.； quercetin； kaempferol

山柰为姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根茎，主产于云南、广东、广西等地区，具有温中散寒、行气止痛等功效，临床主要用于治疗胸膈胀满、脘腹冷痛、饮食不消、风湿关节痛等。近年来有关山柰的研究主要集中在山柰挥发油的提取、化学成分分析、生物活性等方面，而山柰中槲皮素、山柰素等黄酮类成分的报道较少[1-3]，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）对山柰药材中的槲皮素、山柰素的含量进行测定，为控制药材质量、制定质量标准等提供参考。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪（包括CTO柱温箱，SIL-10AF自动进样器，LC-15C泵，SPD-15C紫外检测器）。AUW-120D型分析天平（岛津公司）、电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），KQ3200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DFT-50手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

山柰素（中国食品药品检定研究院，批号110861- 201310）；槲皮素（中国食品药品检定所研究院，批号110754-201308）；甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号20140318）；磷酸（南昌鑫光精细化工厂，分析纯）；山柰药材购自江西敦寿堂国药有限公司，经江西中医药大学褚小兰教授鉴定为姜科植物山柰Kaempferia galanga L.；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：迪马ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸（47∶53）；流速：1 mL/min；检测波长：367 nm；柱温：30 ℃。理论板数按山柰素峰计算应不低于3000。

2.2 混合对照品溶液的制备

取槲皮素、山柰素对照品适量，精密称定，置于25 mL量瓶中，加适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.165、0.146 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取山柰药材适量，烘干、粉碎、过筛，取粉末（过65目）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密称定，超声提取（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再精密称定，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液15 mL置于烧瓶中，加盐酸溶液（15→37）5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，取出，置于冷水中迅速冷却，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得[4]。

2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定槲皮素和山柰素峰面积。以槲皮素、山柰素浓度对其峰面积绘制标准曲线，得回归方程：槲皮素Y=7E+0.6X-48 953，r=0.999 7；山柰素Y=7E+0.4X-49 731，r=0.999 5。结果表明，槲皮素在0.016 5～1.65 μg范围内呈现良好的线性关系，山柰素在0.014 6～1.46 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算峰面积，结果槲皮素峰面积RSD=1.89%，山柰素峰面积RSD=1.56%。表明精密度良好，符合含量测定的基本要求。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1”项下色谱条件测定，计算得槲皮素峰面积RSD=1.96%，山柰素峰面积RSD=2.14%，结果表明，山柰素在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批山柰药材粉末（过65目），按“2.3”项下方法平行制备6份样品，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1”项下色谱条件测定，计算得槲皮素峰面积RSD=1.48%，山柰素峰面积RSD=1.29%。结果表明，本方法测定山柰中山柰素的含量，重复性较好。

2.8 加样回收率试验

取同一批已知槲皮素及山柰素含量的山柰药材粉末（过65目）6份，每份约0.2 g，精密称定，分别加入混合对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备溶液，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1、表2。

2.9 样品含量测定

根据已建立的含量测定方法，取3批山柰药材粉末（过65目），每批3份，称取适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定其峰面积，分别代入线性回归方程，计算山柰药材中槲皮素、山柰素的含量，结果3批样品中槲皮素含量分别为0.082%、0.086%、0.079%，山柰素含量分别为0.066%、0.058%、0.063%，见表3。色谱图见图1。

3 讨论

山柰除含有挥发油外，还有大量黄酮类化合物，如槲皮素、山柰素等，槲皮素具有清除氧自由基、抗过敏、抗菌、抗病毒、降血糖、防癌治癌等药理活性，山柰素则具有抗菌、消炎、镇痛、抗溃疡及抑制HIV蛋白酶活性等药效。可见，山柰是一种极具发展潜力的中药材，但2010年版《中华人民共和国药典》仅对山柰中挥发油的含量有规定，而未对槲皮素、山柰素等黄酮类成分含量进行规定，相关研究报道亦较少，故建立HPLC同时测定山柰药材中槲皮素、山柰素等黄酮类含量的方法，对于药材质量控制、合理选用药材等具有较大的借鉴意义[5-6]。

笔者考察了加热回流提取法和超声提取法的提取效果，结果显示，2种方法所得提取物中槲皮素、山柰素含量未出现明显的差异，但加热回流法的出膏率较超声提取法明显增加，HPLC图杂质峰略有增加，影响槲皮素、山柰素的分离，故采用超声提取法用于山柰中槲皮素、山柰素的提取。同时对提取时间进行了考察，分别比较了15、30、45、60 min的提取效果，结果显示，槲皮素、山柰素在30 min内基本提取完全，时间进一步延长，二者的含量未出现显著提高，故含量测定时采用超声提取30 min即可。

文献报道，山柰药材中槲皮素、山柰素等成分是以苷类的形式存在，提取物中仅含有少量的槲皮素、山柰素，不能较为客观地反映其真实含量[7]，故测定山柰药材中的槲皮素、山柰素时，需对提取物进行水解。笔者参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）红花中山柰素含量测定的样品处理方法，于提取物中加入适量稀盐酸，水浴中加热水解30 min即可[8-9]。试验采用甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相，为了得到较好的分离效果，对流动相的比例进行了考察，结果显示，当甲醇与0.4%磷酸溶液的比例为47∶53时，槲皮素、山柰素的出峰时间适中，分离度及峰形均比较好，可用于山柰药材中槲皮素、山柰素的含量测定。

结果表明，本研究所建立的方法具有专属性强、回收率高、重复性好等特点，可快速、准确地测定山柰药材中槲皮素、山柰素的含量，对于评价药材的质量具有较大的参考价值。

参考文献：

[1] 谭雄斯.HPLC-UV-ELSD法测定益肝乐颗粒中槲皮素、山柰素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d[J].中成药，2014，36（3）：531-535.

[2] 李慧，许亮，徐保利，等.HPLC测定地锦草中没食子酸、槲皮素及山柰素含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：100-102.

[3] 杜小伟，王京辉，肖斯婷，等.高效液相色谱法测定不同来源罗布麻叶中槲皮素和山柰素的含量[J].中国中医药信息杂志，2013，20（1）：51- 53.

[4] 梁选革，张若燕，刘莉丽.红花注射液中槲皮素和山柰素含量的同效液相色谱测定[J].时珍国医国药，2012，23（10）：2475-2477.

[5] 黄瑞松，雷沛霖，苏青，等.壮药茉莉花槲皮素和山柰素含量测定方法的建立[J].广西医科大学学报，2013，30（1）：38-41.

[6] 胡顺莉，俞致，吴虹，等.苦丁茶提取物质量分析[J].安徽中医药大学学报，2014，33（2）：81-84.

[7] 胡婧，王璐瑶，万定荣，等.珠芽景天抗肿瘤活性研究及槲皮素和山柰素的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（24）：139-142.

[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：27.

[9] 梁洁，余靓，柳贤福，等.HPLC 法同时测定龙眼花中3种黄酮类化合物含量[J].世界科学技术-中医药现代化，2013，15（7）：1576-1580.

（收稿日期：2015-09-16）

（修回日期：2015-09-28；编辑：陈静）