龙牙百合快速繁殖与脱毒分析

袁从兵

摘 要 龙牙百合以球茎的无性繁殖为主，此繁殖方式虽可保证龙牙百合的顺利繁衍，却使品种出现了明显的退化，抗病性也随之降低。目前，龙牙百合的脱毒主要以茎尖脱毒为主，研究其快速繁殖及脱毒技术意义重大。

关键词 快速繁殖；茎尖脱毒；龙牙百合；组培快繁；球茎

中图分类号：S567.239；S644.1 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）01-00-02

在百合的诸多分支中，龙牙百合是最为名贵的一支，这种百合既在食用方面具有丰富的营养价值，又在药用方面有着无可比拟的疗效，经人工所制成的龙牙百合干片畅销于港台及东南亚。其种植位置以湖南省隆回县（2009年国家工商总局认定为地理标志证明）为中心，遍及周边多个乡镇，当地种植面积稳定在6.67 hm2左右，产量高达1万余t，即使排除每667 m2数十万元的生产成本，其生产总值依然高达2.2亿元左右[1]。当地种植模式以多年连栽、根茎无性繁殖为主，尽管农民种植的积极性很高，但品种的退化却无可避免，危及根茎的病害逐年增加，种植成本不断提高，产量也因此而明显下降。目前，龙牙百合在繁殖与脱毒上面临着许多难题，亟待解决。

1 快速繁殖

1.1 外植体处理

龙牙百合可以无性繁殖，故其鳞片、茎叶、根尖、花瓣、子房、花丝、顶芽、胚及花梗均能够作为外植体进行组织培养。据相关试验结果证实，龙牙百合以鳞片切块进行组织培养时，分化率最好。也就是说，龙牙百合若要快速繁殖，鳞片是最佳外植体，大部分繁殖者都选择鳞片实施初代培养。

而外植体在进行组织培养之前，需要进行灭菌处理，常规灭菌用品主要有升汞、酒精及漂白粉。其操作流程为：先对外植体进行流线形冲洗，冲洗时间少则15 min，多则1 d；然后以70%～75%的酒精进行预杀菌，杀菌时间从15 s到30 s不等；之后以0.1%的升汞进行10 min左右的灭菌操作；最后用无菌水为龙牙百合鳞片进行5次冲洗，彻底清除掉残余的灭菌药剂。注：以上灭菌操作主要针对鳞片这一外植体[2]。若选择顶芽或叶片作为外植体，则要使用10%的漂白粉进行消毒，时间不得超过10 min。

1.2 组织培养

1.2.1 植株再生

龙牙百合的组织培养可以经3条途径实现植株的再生。其一为器官型，即外植体在诱导下产生不定芽或发育出腋芽，最终形成了丛生芽；其二为胚状体型，即经外植体作直接诱导、由胚状体直接产生，或是外植体的愈伤组织在诱导下形成了胚状体，并且胚状体完全经历了球形、心形、鱼雷形多个阶段，发展为成熟胚，在形态学上与合子胚即为相似；其三为器官发生型，这种类型与器官型有所不同的是，先经外植体诱导，形成一种愈伤组织，再分化为不定芽。

1.2.2 培养基选择

除了植株再生，培养基类型的选择也是非常重要的。一般来说，龙牙百合所用培养基均是固体培养基。就目前的研究结果来看，MS是使用最为广泛的培养基类型。有关研究人员对MS、White3及B5这3种培养基进行了分化效果试验，通过对比可知，MS培养基的分化效果最好，B5培养基次之，White3培养基再次之。

1.2.3 生长调节剂的使用

在龙牙百合的培养中，生长调节剂也是必不可少的使用要素。以6-BA为例，使用这种生长调节剂的不定芽在分化上有明显的促进表现，若将其添加到MS培养基中，外植体上的不定芽将会直接分化出来。并且，随着这种生长调节剂浓度的不断上升，分化率也会不断增加。需要注意的是，6-BA的浓度上限为2 mg/L，若是超过这一限度，分化率反而会不断下降[3]。故组织培养时6-BA的使用浓度最好在0.5～2.0 mg/L。

除6-BA，NAA也是组织培养中常用的一种生长调节剂，这种生长调节剂既可以促进愈伤组织的形成与分化，也可以诱导生根，更在不定芽的分化上有非常显著的抑制效果。需要注意的是，NAA的显著效果要与6-BA联用才能显现出来，单用NAA，不定芽分化率在30%以下，若与6-BA联用则愈伤组织在诱导率上将会攀升到70%以上。此外，NAA在联合使用时，若剂量添加过大将会导致不定芽颜色变浅，这意味着NAA在与6-BA联合使用时不可添加过多，最好控制在0.1～0.5 mg/L。若单用，则NAA的最佳使用剂量为2 mg/L，这一剂量可以保证100%出根率，且根须洁白而粗壮，量大而效果优良。

2 脱毒

就一个多世纪以来对百合坏死条纹的研究而言，可以发现百合的病毒病原共有14种，其中以潜隐病毒、郁金香碎花病毒、黄瓜花叶病毒、异名百合斑驳病毒以及百合丛簇病毒五种危害最为严重。这5种病毒病原同样可以危及龙牙百合的繁殖与生长。在我国，初代百合的病毒病发生率约为50%，二代种球则有高达90%的带毒率，这使得百合在产量和治疗大打折扣。就龙牙百合的受危害特点而言，有以下几个：一是多种病毒对植株进行复合式侵染，表现复杂、危害严重；二是病毒传播速度快，在植株内分布极不均匀，初次侵染部位与二次侵染部位有不同的患病表现。一般来说，龙牙百合在受到侵害之后，植株明显矮化，花叶与叶脉出现畸形，鳞片与根茎也显著缩小，产量与品质都有明显降低，开花数目变少，部分植株甚至盲花或枯死。对于上述情况，可以应用如下几种方法进行脱毒处理。

2.1 茎尖培养

通过试验对比病毒在不同器官、组织中的含量可以发现，老旧器官内的病毒含量比较高，而在未成熟的组织器官及幼嫩的莖尖中，病毒含量则比较低。这是因为茎尖通常是整个植株上细胞分裂活性最高的部位，组织培养价值高；且该处不存在纤维管束，细胞间没有连丝，病毒无法传递过来。利用这一特点，可以通过剥取茎尖组织进行培养来实现脱毒目的。对于龙牙百合来说，可以选择叶原基有1个或2个、长度为0.2 mm或0.3 mm的茎尖进行无毒培养。

2.2 愈伤组织培养

龙牙百合的最佳外植体为鳞片与茎尖，通过这些外植体对愈伤组织进行诱导并分化出无毒苗或鳞茎，同样可以实现脱毒目的。这种脱毒方法的有效率为30%～47%。虽然效果不够理想，却有很强的实验室可行性，且其分化率控制起来比较容易，脱毒周期也比较短。最为重要的是，该法在一次性成苗上具有批量性优势，故该法可以用于首次脱毒，之后再联合其他方法进行二次脱毒。

2.3 热处理加茎尖培养

借助高温令病毒发生钝化，使其复制行为不断变慢，直到最终停止下来，即是热处理脱毒技术。而植株的嫩梢在高温培养期间并没有携带病毒，故可以将之作为培养对象进行脱毒培养处理。热处理这种脱毒技术具有设备简便、操作简单的优点，但缺点也非常明显。不仅脱毒不够完全、脱毒周期过长，热处理时温度也难以准确控制。无论是温度过高（超过37 ℃）还是高温时间过长（超过20 d），都会使植株的存活率大大降低。并且，各种病毒病原各有其温度敏感性，龙牙百合所感染的病毒可能有多种，热处理法难以兼顾各方，故效果始终有限。只有在联合茎尖培养法之后，其脱毒效果才有显著提高。

2.4 化学药剂加热处理加与茎尖培养的脱毒方法

此方法主要借助化学试剂来阻断病毒的继续合成，所用化学试剂主要有孔雀绿、病毒唑、8-氮鸟嘌呤及硫尿嘧啶等。这些药物无法使病毒失去活性，仅仅能起到阻断病毒合成的效果，并对植株有一定的危害，故应在使用上严格控制其剂量。一般来说，单用化学试剂的脱毒率可以达到50%～60%，弱与热处理法及茎尖培养法联合应用，可以有效提高脱毒率。该方法先以热处理法使病毒不断钝化，同时辅以化学试剂阻断病毒合成，最后借助茎尖培养获得无毒苗，故在脱毒率上高达80%。可以说，此法是本文所介绍的脱毒方法中效果最好的一种。相关研究显示，培养基中若含有10 mg/L的DHT溶液，则培养基中的不定芽将有非常优秀的脱毒效果，病毒检出率低至0%。

2.5 低温疗法

此方法将植株组织以超低温度保存，并将茎尖进行离体培养，是一种诞生时日尚短的新兴脱毒方法，其脫毒率可以与化学药剂加热处理加与茎尖培养方法相媲美，但因诞生不久而应有有限。就现有研究结果来看，将百合的茎尖进行1 h的超低温处理之后再行增殖培养，新苗的脱毒率可以超过90%。若选择液态氮对龙牙百合进行超低温脱毒，应将温度控制在4 ℃左右。若将剥取长度为0.5 mm的茎尖培养20 d，并以液态氮冷藏24 h，再以40 ℃水解冻，龙牙百合的脱毒率将能达到88.70%，出芽率也能达到62.7%左右。

3 结语

龙牙百合在药用与食用上均有极为显著的价值，这使得经济市场对这种事物产生了较大的需求。而与之矛盾的是，龙牙百合在繁殖上却出现了许多问题，无性繁殖导致品种退化、品种退化导致病虫害繁多，这无疑是不利于龙牙百合的健康发展的。对此，相关工作者从龙牙百合的快速繁殖与脱毒2个方面进行改进，试图推动品种的进化，提高其抗病毒能力，以此来增加产量，带来更多的经济利益。本文对龙牙百合的快速繁殖技术与脱毒技术进行了简单的阐述，以供从事此方面工作或此方面研究的人员参考。

参考文献

[1]胡新颖，杨迎东，颜津宁，等.百合种球脱毒技术研究进展[J].江苏农业科学，2014（4）.

[2]阮瑶瑶，丁健，杨懋勋.药用、食用、观赏用百合组培快繁研究进展[J].深圳职业技术学院学报，2011（1）.

[3]杨柏云，罗丽萍，高荫榆.龙牙百合脱毒技术的研究[J].安徽农业科学，2008（6）.

（责任编辑：赵中正）