象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶新基因Me—pel2的鉴定及发育表达分析

龙海波　孙燕芳　曾凡云　彭军　白成

摘 要 利用EST结合RACE方法从象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）中克隆一个新的果胶酸裂解酶基因Me-pel2（GenBank登录号KP987180）。Me-pel2 cDNA开放阅读框全长834 bp，推导编码277个氨基酸残基的蛋白，属于多糖裂解酶第III家族新成员。Me-PEL2与南方根结线虫果胶酸裂解酶Mi-PEL3氨基酸具有较高的一致性，为54%。发育表达结果显示，Me-pel2在2龄幼虫和雄虫期高丰度表达，而在固着期寄生阶段转录水平急剧下降，推测Me-pel2主要在象耳豆根结线虫迁移性阶段起重要作用，通过降解寄主细胞壁果胶质成分，协助幼虫侵入寄主以及在寄主体内迁移。

关键词 象耳豆根结线虫；果胶酸裂解酶；基因克隆；发育表达类型

中图分类号 S436.3 文献标识码 A

Abstract Cloning and identifying parasitism genes are the keys to understand the molecular basis on nematode parasitism of plants. In this study， a new pectate lyase gene Me-pel2（GenBank accession no. KP987180）was cloned from the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii by EST analysis and RACE technology. The open reading frame of Me-pel2 cDNA was 834 bp long and encoded a deduced 277 amino acid sequnce belonging to polysaccharide lyases famlily III. The deduced protein Me-PEL2 shared high identity（54%）with pectate lyase Mi-PEL3 from M. incognita. Semiquantitive RT-PCR analysis confirmed that Me-pel2 transcripts were strongly detected in motile stages（second stage juveniles and adult males）and were weak in sedentary stages. These results indicated that Me-PEL2 may play a role in plant cell wall-degrading during the penetration and migration of M. enterolobii in plant tissues.

Key words Meloidogyne enterolobii； Pectate lyase； Gene clone； Developmental expression pattern

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.017

象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）属于热带根结线虫种类，在亚洲、非洲和欧美等地区均有发生分布，具有寄主范围广、毒性强和危害大的特点，并且能在携带Mi抗原基因的辣椒和番茄上寄生繁殖[1-5]。象耳豆根结线虫是中国华南地区最为重要的根结线虫种类之一，在广东和海南为害多种蔬菜和热带水果作物并造成重大损失，然而目前依然缺乏有效的防治措施[6-10]。分离和鉴定象耳豆根结线虫致病因子是了解其分子寄生致病机制和提出新防治策略的重要基础。植物线虫在寄生过程中，一方面利用其特有的口针猛烈穿刺破坏细胞壁物理结构，另一方面通过分泌一系列的细胞壁降解酶，打断或消除细胞壁化学作用力达到松弛和降解细胞壁成分的目的，从而协助线虫侵入寄主以及在寄主体内迁移[11]。果胶酸裂解酶（Pectate Lyase，PEL）是细胞壁降解酶的一种，通过β-消除法裂解脱甲基或低甲酯的同型聚半乳糖醛羧（果胶酸）之间的α-1，4糖苷键，起降解細胞壁主要成分果胶质的作用[12]。果胶酸裂解酶可由细菌、真菌、线虫和植物等有机体产生，分布在多糖裂解酶家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ和Ⅹ等5个家族，目前已鉴定的植物线虫源果胶酸裂解酶均属于多糖裂解酶第Ⅲ家族成员。2000年Popeijus等[13]从马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis）中分离克隆了第一个植物寄生线虫果胶酸裂解酶基因Gr-pel1，其编码的蛋白具有酶活性功能，这也是首个动物非共生降解果胶质的实例。Doyle等[14]利用免疫定位证实了爪哇根结线虫（Meloidoyne javanica）中克隆的果胶酸裂解酶Mj-pel1的编码产物能够被分泌到体外起作用。近10年来，国内外又先后从大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）、南方根结线虫（M. incognita）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）、甜菜孢囊线虫（H. Schachtii）和象耳豆根结线虫（M. enterolobii）等一些重要植物线虫中分离克隆了多个果胶酸裂解酶基因[15-20]。Vanholme等[18]利用RNA干扰技术（RNA interference， RNAi）将甜菜孢囊线虫Hs-pel2沉默后，导致线虫的侵染率下降了50%以上。Bakhetia等[21]和Sukno等[22]先后对大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel1利用RNAi沉默，结果显示，大豆孢囊线虫雌虫数量大幅度减少，而雄虫数量增多。卓侃等[20]用RNAi使象耳豆根结线虫果胶酸裂解基因Me-pel1沉默下调表达，引起侵染性2龄幼虫对携带Mi抗性基因和不携带Mi的番茄栽培品种的侵染率显著下降。一系列研究结果表明，果胶酸裂解酶是植物线虫侵染寄生过程中分泌的一类重要致病因子。

本研究通过克隆果胶酸裂解酶Me-pel2基因全长并分析其发育表达类型，了解Me-pel2在象耳豆根结线虫寄生过程中的作用特点和功能地位，为阐明线虫-寄主互作提供新的分子数据，同时为防治象耳豆根结线虫提供候选靶标基因。

1 材料与方法

1.1 材料

供试象耳豆根结线虫种群源于海南乐东佛罗镇的辣椒病根，并经温室内单卵囊纯化培养，接种寄主为番茄（cv. 特级大明星）。

1.2 方法

1.2.1 线虫分离与收集 取象耳豆根结线虫单卵囊接种90 d左右的番茄病根，经1%的食用色素亮蓝染色后于解剖镜下挑取根表面的卵囊，并在室温25 ℃条件下孵化获得，2龄幼虫。取接种2龄幼虫（约100 000头）第2天、第7天和第13天的番茄病根，参照Ding等[23]描述的方法分离收集根内不同发育阶段的幼虫虫体。取接种2龄幼虫35 d的番茄病根，解剖镜下用挑针直接从根内分离获得雌成虫。获得的各虫体经无菌的PBS缓冲液清洗，进行后续实验或保存于液氮中备用。

1.2.2 核酸提取与合成 采用TRIzol法提取象耳豆根结线虫2龄幼虫及各虫态的总RNA，具体操作步骤按照说明书进行（Invitrogen）。利用FastQuant RT（with gDNase）试剂盒反转录合成cDNA第一链，操作步骤按照说明书进行（TIANGEN）。利用GeneRacerTM RACE 试剂盒（Invitrogen）反转录合成含5′及3′末端接头的RACE模板，具体步骤参照说明书进行。

1.2.3 Me-pel2 cDNA全长克隆 根据实验室已获得的象耳豆根结线虫cDNA文库序列信息，设计Me-pel2基因末端扩增特异引物Me-E1（AGCGCCT

CCTCCATCTACGATATATG）和Me-E2（TCAACACAA

TATACATATATCGTAG）。利用RACE技术扩增获得Me-pel2基因5′及3′末端序列，其中5′RACE-PCR所用引物为Me-E1和GeneRacerTM 5′primer（CGACTGGAGCACGAGGACACTGA），反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL，Ex taq酶0.5 μL， RACE模板1 μL，灭菌双蒸水31.5 μL。褪火温度为56 ℃，共35个循环。3′RACE-PCR所用引物为Me-E2和GeneRacerTM 3′primer（GCTGTCAACGATACGCTACG

TAACG），反应体系与5′RACE-PCR一致。褪火温度为58 ℃，35个循环。根据所获的末端序列，设计Me-pel2 cDNA全长特异引物MeP2-F（ATGCTTA

ATATATTAATTTTAATTATTT）和MeP2-R（TCAATT

GACCACTTTAAAT），扩增Me-pel2 cDNA全长。反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL，Ex taq酶0.5 μL，cDNA模板1 μL，灭菌双蒸水31.5 μL。褪火温度为55 ℃，35个循环。PCR产物经电泳检测后，纯化连接至pGM-T载体（TIANGEN），送华大基因公司测序。

1.2.4 半定量RT-PCR 应用Oligotex mRNA Mini（QIAGEN）试剂盒，参照说明书对提取的象耳豆根结线虫各虫态总RNA进行纯化，获得mRNA。取各虫态等量mRNA（200 ng）反转录合成cDNA第一链。以第一链为模板，结合Me-pel2特异引物RT-F（GGTTCAGTCATTAGTGGCTACAA）和RT-R（AACA

ATCGTTAAATCTCGTTGAT）进行PCR扩增。同时利用引物ActinF（AACCTCTGCCCCTTCTTGTGCTG）和ActinR（AACGTTCAACGCCCAATGAAAGT）扩增β-actin基因作为阳性对照。PCR反应体系参照3′RACE-PCR，褪火温度为58 ℃，设置28和35兩个循环数，扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 序列分析 序列比对和同源性搜索在NCBI网上进行（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。应用Signal P v 4.0进行信号肽及切割位点预测。蛋白分子量和等电点由在线软件PROTEIN MACHINE预测（http：//us.expasy.org/tools/）。利用MEGA 6.0 软件的邻接法构建系统进化树，建树步长重复数为1 000次[24]。

2 结果与分析

2.1 Me-pel2 cDNA克隆与序列分析

通过5′和3′RACE-PCR反应分别获得了长度为463 bp的5′末端及长度为525 bp的3′末端序列，而根据末端序列所设计的Me-pel2基因全长特异引物扩增获得了一个长度为800 bp左右的条带（图1）。测序结果证实该序列实际长度为834 bp，为一个完整的开放阅读框，起始密码子ATG，终止密码子为TGA，推导编码长度为277个氨基酸的蛋白序列。相似性搜索比对（Blastx）显示，该cDNA与NCBI数据库中根结线虫、孢囊线虫等植物寄生线虫以及一些真菌和细菌的果胶酸裂解酶基因同源，一致性在16%～54%之间。同时，该cDNA编码的氨基酸序列含有一个果胶酸裂解酶保守结构域，位于亮氨酸Leu73至缬氨酸Val244之间。因此，从象耳豆根结线虫中克隆获得的cDNA全长序列为一个新的果胶酸裂解酶基因，笔者将其命名为Me-pel2，并在NCBI GenBank提交注册，登录号为KP987180。

2.2 Me-PEL2蛋白特征及系统进化分析

象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶Me-PEL2蛋白序列由277个氨基酸残基组成，预测分子量为29.86 ku，等电点pI为8.67。Signal P软件预测Me-PEL2蛋白N端含有一个起分泌功能的信号肽前体序列，长度为16个氨基酸残基，剪切位点位于丙氨酸Ala16与异亮氨酸Ile17之间（图2）。BlastP 搜索结果显示，Me-PEL2與南方根结线虫（M. incognita）果胶酸裂解酶Mi-pel3（GenBank No： AY861685）具有较高的一致性，为54%。Me-PEL2与植物线虫的其它果胶酸裂解酶一致性均较低，其中与孢囊线虫果胶酸裂解酶一致性在30%～33%之间，而与象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶Me-pel1（HQ180169）的一致性仅为23%。保守结构域搜索及多序列比对结果表明，象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶Me-PEL2属于多糖裂解酶第Ⅲ家族，具有第Ⅲ家族典型特征的4个高度保守区域，且含多个保守的半胱氨酸残基和带正电荷残基，为果胶酸裂解酶的活性位点（图2）。

从GenBank中选取与Me-PEL2具有同源性的30个植物寄生线虫、细菌和真菌的果胶酸裂解酶氨基酸序列，运用MEGA6.0软件邻接法进行系统发育树构建。结果显示，植物寄生线虫的果胶酸裂解酶聚为4个进化分支，分别为NematodeⅠ、NematodeⅡ、NematodeⅢ和NematodeⅣ（图3）。象耳豆根结线虫Me-PEL1和Me-PEL2属于不同分支，其中Me-PEL1与南方根结线虫Mi-PEL1、爪哇根结线虫Mj-PEL1形成一个小的分支（NematodeⅠ），并且与来自细菌和真菌的果胶酸裂解酶聚为一个较大的分支。Me-PEL2与南方根结线虫Mi-PEL2和Mi-PEL3，以及拟禾本科根结线虫Mg-PEL1聚为一个小的独立分支（NematodeⅢ）。多个孢囊线虫果胶酸裂解酶基因包括大豆孢囊线虫Hg-PEL1，Hg-PEL2和Hg-PEL5、甜菜孢囊线虫Hs-PEL1、马铃薯白线虫Gp-PEL、马铃薯金线虫Gr-PEL1以及烟草孢囊线虫Gts-PEL1和Gv-PEL1聚为一个大的分支（NematodeⅣ）。其余植物线虫果胶酸裂解酶包括甜菜孢囊线虫Hs-PEL2、马铃薯金线虫Gr-PEL2、燕麦真滑刃线虫Aa-PEL1和Aa-PEL2、松材线虫Bx-PEL1和Bx-PEL2以及拟松材线虫Bm-PEL1和Bm-PEL2则构成另外一个较大的分支Nematode PEL3-II。

2.3 Me-pel2在根结线虫各虫态的表达

通过运用RT-PCR分析象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因Me-pel2在卵期，侵染前2龄幼虫，侵染期2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、雌成虫及雄虫等虫态的发育表达特征。电泳检测结果显示，Me-pel2在象耳豆根结线虫各虫态均有转录表达，但表达丰度不同（图4）。以象耳豆根结线虫在各虫态稳定表达的持家基因β-actin为对照，Me-pel2 在侵染前和侵染期2龄幼虫中以及雄虫阶段表达量相对最高，电泳条带清晰明显，而在卵期表达量次之。在3龄、4龄幼虫以及雌成虫期，Me-pel2转录丰度显著降低，电泳检测信号微弱。

3 讨论与结论

克隆和鉴定植物线虫寄生致病相关基因是解析其分子寄生机制的关键途径，也是当今国际植物线虫学研究的热点方向。果胶酸裂解酶作为关键植物细胞壁降解酶类之一，在植物寄生线虫成功侵染寄生过程中具有重要地位，参与到植物线虫侵入寄主、在寄主体内迁移以及诱导取食位点形成等过程[21，25-27]。本研究从象耳豆根结线虫中克隆了一个新的果胶酸裂解酶基因Me-pel2，编码蛋白Me-PEL2的N端含有16个氨基酸残基的信号肽，同时内部有4个保守肽段和多个半胱氨酸残基，符合多糖裂解酶第Ⅲ家族特征[13，28]，确定Me-PEL2为多糖裂解酶第Ⅲ家族新成员。

象耳豆根结线虫Me-PEL2与其它植物寄生线虫果胶酸裂解酶一致性在20%～54%之间，与真菌和细菌的果胶酸裂解酶进行聚类分析的结果中，植物线虫果胶酸裂解酶并没有形成一个共同的进化分支，而是分散在4个独立的分支，该结果与一些文献所报道相似[17，29]。半定量PCR研究结果表明，象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因Me-pel2在迁移性幼虫和雄虫期表达丰度最高，而在固着期寄生阶段转录水平急剧下降，该结果与南方根结线虫3个果胶酸裂解酶基因的发育表达类型一致[16]。结果说明，果胶酸裂解酶基因的表达及其产物的分泌与植物线虫寄生行为密切相关。象耳豆根结线虫属于专性固着性内寄生，仅在侵染性2龄幼虫和雄虫期具有迁移能力，Me-pel2在2龄幼虫和雄虫期高丰度表达，表明其蛋白产物主要在迁移性寄生阶段起作用，通过降解寄主细胞壁果胶质成分，协助线虫侵入寄主（2龄幼虫）以及在寄主体内迁移（侵染期2龄幼虫和雄虫）。在3龄幼虫、4龄幼虫和雌成虫期，象耳豆根结线虫呈固着态从取食位点攫取营养物质，这些发育阶段Me-pel2表达量显著降低，表明其蛋白产物在寄生阶段后期的发育过程不具有重要作用。此外，Me-pel2在卵期表达量也相对较高，推测可能是已有卵块即将蜕皮发育成侵染性，2龄幼虫，Me-pel2开始诱导表达有助于孵化后能够立即侵染寄主植物。

象耳豆根结线虫能够突破Mi介导的抗性反应，在对南方根结线虫、爪哇根结线虫等多种根结线虫具有抗性的作物上寄生繁殖，表明其与寄主植物建立亲和互作关系，具有独特的分子机制。然而，目前有关象耳豆根结分子致病机理的研究还处于初始阶段，有关象耳豆根结线虫寄生致病相关基因的报道很少。本研究克隆鉴定了一个新的果胶酸裂解酶基因Me-pel2，通过研究Me-pel2序列特征和发育表达类型，为解析Me-pel在象耳豆根结线虫寄生过程中的作用特点奠定了基础，同时为了解象耳豆根结线虫的分子寄生致病机理提供，新的分子证据，后续研究中可结合利用RNAi技术进一步对Me-pel2进行功能验证。

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责任编辑：赵军明