海南飞机草病原真菌鉴定、致病力测定及其寄主范围分析

李雨龙　杨叶　韦诚　符旖晴

摘 要 对海南多个市县的飞机草发病情况进行调研发现，飞机草叶斑病受自然环境及病菌种类的影响，从发病样品上分离获得46株病原真菌。经过形态学观察与分子鉴定比对，确定飞机草的重要病原真菌分别为：链格孢Alternaria alternata、新月弯孢Curvularia lunata和尖孢镰刀菌Fusarium oxysporu。通过离体叶片针刺法和活体接种法对病源真菌致病力进行测定，结果显示，强致病力菌株12个（占26.09%），中等致病力菌株13个（占28.26%），弱致病力菌株19个（占41.30%），无致病力菌株2个（占4.3%），其中链格孢菌株LGB100501、LGB100401和弯孢菌株WB110216表现出较高的致病力。利用11个高致病力菌株针对8种海南常见杂草进行寄主范围测试，结果表明，不同菌株致病力存在差异，仅有13.6%的供试杂草对这些菌株表现出高度和中度感病。

关键词 海南；飞机草；病原真菌；致病力；寄主范围

中图分类号 S451.1 文献标识码 A

Abstract The investigation and sampling of the infection situation of Chromolaena odorata in some regions of hainan revealed that the leaf spot was influenced by natural environment. 46 pathogenic fungi were isolated. Based on morphological characteristics and sequence alignments of rDNA ITS region，the most important pathogen fungi of C. odorata were identified as Alternaria alternata， Curvularia lunata and Fusarium oxysporu. The virulence of the strains were determined by inoculation in vitro and in vivo. The results showed that the high-pathogenic strains were 12（26.09%），the medium-pathogenic were 13（28.26%），the low-pathogenic were 19（41.30%），and non-pathogenic 2（4.3%）. The virulence of LGB100501， LGB100401 and WB110216 were very high. High virulence of 11 strains to 8 weeds showed that different strains had differences in virulence，highly susceptible and moderately susceptible accounted for only 13.6%.

Key words Hainan；Chromolaena odorata；Pathogenic fungi；Virulence；Host range

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.029

飞机草（Chromolaena odorata L）是菊科（Compositae）泽兰属（Eupatorium）多年生杂草，学名香泽兰[1]，是IUCN 确定的全球100种最具破坏力的入侵生物之一，该草遍布海南全岛，对海南农林牧业的生产、物种多样性和生态系统安全造成了严重危害。越来越多的研究表明，筛选和利用本土天敌控制入侵生物是一条简捷安全的途径。迄今为止，已有不少应用病原真菌防治入侵杂草的成功实例，并产生不少商品化的生物制剂[1-3]。

目前，国内对飞机草的研究主要集中在入侵生态学方面，并取得了突破性进展，而有关飞机草生物防除的相关研究工作较为落后，尤其是有关病原微生物控制与应用的研究报道较少。海南作为国内发现飞机草较早且危害最严重的地区，野外存在自然感病的植株，这为筛选和利用本土天敌控制入侵恶性杂草的研究工作提供了有利条件。但是，目前还没有研发出能够成功用于飞机草防治的真菌除草剂。已报道的飞机草致病菌主要有从叶片上分离的泽兰尾孢Cerospora eupatorii（又名Mycovellosiella perfoliata）、 假尾孢Pseudocercospora eupatorii-formosani、鏈格孢Alternaria alternata、Anhellia niger和Colletotrichum sp.、Septoria ekmaniana等[4-6]，从花序上分离到的Aureobasidium pullulans对飞机草也具有极高的生防潜力[7]。笔者于2013～2014年对海南地区的飞机草真菌病害进行调查，经分离获得大量致病菌株，并对其展开致病力及寄主范围的测定，对其潜在的生防价值进行初步评估。

1 材料与方法

1.1 材料

飞机草：采集自海南各个地区自然发病的飞机草；接种材料：从海南大学环植学院教学基地及其周边采集健康无症状的飞机草叶片及幼苗。

PDA培养基：1 000 mL蒸馏水，200 g马铃薯，20 g琼脂。

1.2 方法

1.2.1 田间调研 调查时间：2013年9～10月、2014年4～6月。调查地区：海口、东方、澄迈、临高、儋州、昌江、乐东、三亚等市县。调查方法：以田间、村庄等为主，以5 km为调查单位，沿途记录飞机草种群、分布情况、生长环境等。采集发病的叶片，记录飞机草发病症状及病害发生程度。

1.2.2 致病菌的分离与形态学鉴定 从野外采集自然感病的飞机草，记录典型的发病症状后，采用常规的组织分离法对病菌进行分离培养、纯化并将其接种到原杂草[8]；确定是致病菌后再作属或种的鉴定[9]。

1.2.3 重要病原菌的分子鉴定 待菌株在PDA培养基上培养7 d后收集菌丝，用CTAB法提取菌株DNA，PCR扩增引物为真菌ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。对rDNA的ITS区域进行PCR扩增，扩增体系：Buffer（含Mg2+）2.5 μL，引物ITS1（10 μmol/L）以及ITS4（10 μmol/L）各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPS 1μL，Taq聚合酶0.2 μL，模板DNA 0.5 μL，用双蒸灭菌水将体积至25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min后，94 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。将PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳分离后，于EB溶液（0.5 μg/mL）中染色15 min，通过凝胶成像系统检查电泳结果。将PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序，采用B1ast程序将其与 GenBank上的序列进行相似性比较。

1.2.4 致病力测定 （1）菌丝对离体叶片的致病力测定。根据柯赫氏法则，采用离体叶片针刺法。取健康、大小均一的飞机草叶片，先用4%次氯酸钠溶液消毒1 min，后用无菌水冲洗3次，再用解剖针穿刺造成轻微伤口，以刺破下表皮而上表皮完好为标准；在培养7 d的菌落边缘打菌块并将其接在刺伤处，以无菌琼脂块为对照，每处理接种3个叶片，共重复3次，置于28 ℃恒温箱中保湿培养；3 d后观察并记录发病的症状，统计发病率及进行病情分级。

病害分级标准如下： 0级为不发病；1级为仅刺伤点有侵染，病斑直径小于1 mm；2级为伤点有侵染，病斑直径1～5 mm；3级为伤点有侵染，病斑直径5～10 mm；4级为伤点有侵染，病斑直径10～15 mm；5级为伤点有侵染，病斑直徑大于15 mm。

（2）菌丝对飞机草活体的致病力测定。选取11株致病力较高的菌株，采用水培法进行测定[10]。从田间采集健康、大小均一的飞机草植株，每株含4～6健康新鲜叶片，于三角瓶中扦插水培，待恢复生长24 h后接种，接种处以薄脱脂棉保湿，7 d后统计发病率和发病情况。其它方法见1.2.4（1）。

（3）寄主范围测试。采用离体叶片针刺法测定11个菌株对常见菊科、禾本科及科杂草的致病力，以了解其寄主范围，7 d后统计发病情况。其它方法见1.2.4（1）。

2 结果与分析

2.1 飞机草自然发病状况及病原情况

海南的飞机草真菌性病害主要有5种，病原分别由链格孢属、弯孢属、炭疽属、镰刀菌属、尾孢属等引起，其中最为常见的是由尾孢属引起的角斑病，在阴暗潮湿、生长密集的地方发病较为普遍，以老叶发病较为严重；由镰刀菌属引起的病害一般发生在叶缘处，病建交界比较明显，病斑初期呈黑褐色，后期病叶逐渐变黄直至枯死，此病害只在儋州和海口两地发现；由链格孢属引起的病害，病斑呈明显的轮纹状，病斑初期为小黄点，后期多为不规则型深黑褐色病斑，叶缘处病斑较为明显，此病害在东方、澄迈、三亚等地大量发生，其余地区零星分布；由弯孢属引起的病害其病斑在叶片上随机分布，与由链格孢侵染引起的病斑轮纹类似，但轮纹不明显，后期病斑稍小，此病害只在儋州和澄迈两地发现，发生较为严重；由炭疽菌属引起的病害病斑为黄褐色的圆形及多角形，初期多从叶尖或叶缘发病，后期病斑连合成片，病部坏死变黑，此病在澄迈和儋州发生。

2.2 重要菌株的鉴定

2.2.1 链格孢（参考菌株LGB100401） 分生孢子梗一般比菌丝粗，颜色比菌丝略深；顶端产生手雷形或椭圆形的分生孢子（图1-a），呈现暗灰褐色，多为单生，大多数具喙，横隔1～5个，纵隔1～2个；孢子大小（31.88～56.79）μm×（10.92～13.61）μm。对其rDNA的ITS序列进行BLAST比对，从发病飞机草上分离的菌株LGB100401（登录号KT209589）与GenBank中Alternaria alternata的相似性为100%。结合形态学与分子鉴定，确定菌株LGB100401为链格孢Alternaria alternata。

2.2.2 新月弯孢（参考菌株WB110216） 分生孢子梗单生或丛生，产于菌丝末端或中间细胞上，直立或弯曲，不分枝，有分隔，淡褐色至暗褐色，顶部产孢区颜色较淡。分生孢子（图1-b）多为单生，深褐色，具隔膜3个，从基部起第3个细胞膨大且弯曲，颜色较深，孢子大小为（10.36～30.85）μm×（4.31～14.33）μm。对其rDNA ITS序列进行BLAST比对发现，从发病飞机草上分离的菌株WB110216 （登录号KT209588）与GenBank中Curvularia lunata的相似性为99%。结合形态学与分子鉴定，确定菌株WB110216为新月弯孢Curvularia lunata。

2.2.3 尖孢镰刀菌（参考菌株LD062203） 分生孢子梗（图1-c），颜色较浅；产孢细胞单瓶梗（图1-d），具分枝；大型分生孢子（图1-e）多为单生，无色，3～5隔膜，足胞明显，顶细胞逐渐变窄，形状有镰刀形、椭圆形等，大小（26.57～36.18）μm×（4.04～4.48）μm；小型分生孢子大小（12.67～15.52）μm×（3.67～4.40）μm，单生，无色，一般为0～1隔膜，形状为肾形等；厚垣孢子大小为（7.80～12.41）μm×（7.82～13.48）μm， 多为簇生或顶生，球型，无横隔。对其rDNA ITS序列进行BLAST比对发现，从发病飞机草上分离的菌株LD061903（登录号KT339743）与GenBank中Fusarium oxysporum的同源性为99%。结合形态学与分子鉴定，确定菌株LD061903为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。

2.3 分离菌株致病力测定

2.3.1 菌丝对离体叶片的致病力初步测定 挑选分离率较高的5种病菌共46个菌株进行致病力测定。结果表明，强致病力菌株共有12株（占总26.09%），中等致病力菌株有13株（占28.26%）， 弱致病力菌株有19株（占41.30%）， 2个菌株无致病力（占4.3%）（表1）。

接种7 d后，供试的病原菌中，链格孢菌株LGB100501病情指数最高为84.00，其次是LGB100401菌株病情指数为79.44，发病症状见图2；弯孢菌株WB110216病情指数最高为76.30；而镰刀菌菌株LD062203（发病症状见图2）和LD061903病情指数最高为56.00；炭疽菌株TJ110205病情指数最高为73.33；未知菌WZ050502、WZ050503菌株病情指数则高达96.75和96.89。

2.3.2 菌丝对飞机草活体的致病力测定 活体致病力测定结果表明，有4个菌株的发病率均达到100%，且病斑扩展较慢，接种7 d的病情指数较低，为30.00～55.00。其它7个菌株的发病率在50%～75%，病情指数在20.00～51.25。致病力达2级的仅有菌株LGB100501 和WB110216（表2）。

2.4 寄主范围测试

11个菌株针对8种供试材料共88个测定中（表3），在不同植物中表现高度感病的菌株共有9个，分别为菌株LGB050503、LGB100401、LD062203（对羽芒菊）；菌株LGB050503、WB110216、LD062203（对马唐）；菌株LD062203（对三叶鬼针草、蟛蜞菊、龙葵）。表现中度感病的菌株仅有3个，分别为菌株LGB100501、WB110216（对蟛蜞菊）和LD062104（对马唐）。所有测定中，高度感病和中度感病的杂草很少，仅占13.6%；此外，少数为轻微致病（病斑不扩散），多数对供试杂草无致病性。

在供试病原菌中，镰刀菌LD062203的侵染力最强，供试的8种杂草中有5种对其极为敏感，表现高度感病；其次是鏈格孢菌LGB050503、弯孢菌WB110216，2种植物对其极敏感或较敏感，表现中度感病；其余供试病原菌侵染力较弱，供试植物对其不敏感或稍敏感。对供试杂草而言，9个杂草表现为高度感病，其中菊科杂草羽芒菊和禾本科的马唐各占3个，表现较为突出。

3 讨论与结论

早期研究指出，飞机草尾孢C. eupatorii侵染速度远滞后于飞机草的生长速率，其生防作用较小[13]，因此，本研究主要针对飞机草链格孢、镰刀菌、弯孢菌3种病原展开研究；通过离体和活体测定综合分析，供试的46个菌株中以链格孢属菌株LGB100501、LGB100401和弯孢属菌株WB110216对飞机草致病力最强。寄主范围测试发现，供试杂草对绝大部分菌株的敏感性较低，具有较高的选择性；菊科杂草羽芒菊和禾本科杂草马唐对部分菌株极敏感。总的来说，上述菌株对其原寄主飞机草的致病力强于对其他寄主植物的致病力。

活体测定与离体测定相比，大部分菌株的致病力都较弱，与自然条件下致病情况存在差异。可能的原因有：一是活体接种的保湿条件不够；二是可能自然条件下大部分飞机草病原菌为复合侵染，而实验室单一病原菌致病力相对较弱。Zachariades等[14]曾指出，从美洲分离的飞机草病原菌难以控制非洲南部飞机草，与该病原菌的致病力及野外的生存竞争能力有很大关系。田间杂草的生物防治是极其复杂的过程，受诸多因素的影响，因此，上述病菌对田间飞机草的生防价值还有待进一步确定。

国内，戴新宾等[15]在恶性入侵杂草紫茎泽兰Eupatorium adenophora病株上分离获得A. alternata，并将其菌丝体成功开发为真菌除草剂。另外，研究表明，链格孢A. alternata和弯孢C. lunata除了具有很强的致病能力外，它们产生的毒素也具有很好的除草活性，是开发新型微生物除草剂的重要材料来源，如AAC-毒素可防治紫茎泽兰，其作为天然除草剂已经申请专利[16-17]。本研究筛选出的链格孢和新月弯孢菌株，表现出良好的生防潜力，其真菌毒素的除草活性研究及活性物质的分离工作正在进行。本研究结果丰富了飞机草的病菌资源和信息，为飞机草的生物防治奠定了基础。

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责任编辑：林海妹