都柳江鲇形目两种经济鱼类种群Cyt b基因的遗传多样性分析

刘伟 代应贵 袁振兴 范家佑

摘要：【目的】研究分析贵州都柳江鲇、斑鳠种群细胞色素b基因（Cyt b）的遗传多样性，为都柳江鲇形目经济鱼类资源的保护和开发利用提供参考依据。【方法】以PCR扩增都柳江鲇、斑鳠种群的Cyt b基因序列，经双向测序、拼接后采用相关在线软件进行序列变异及遗传多样性分析。【结果】都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因序列均为1122 bp，分别检测到46和15个变异位点，对应定义为11个单倍型（NHap1～NHap11）和10个单倍型（BHap1～BHap10）。都柳江鲇、斑鳠种群的单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数分别为0.646、0.00899和0.610、0.00101。都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因序列均编码374个氨基酸，包含20种氨基酸，以亮氨酸平均含量最高（17.65%和16.58%）、半胱氨酸平均含量最低（0.80%和0.78%）。4种碱基在这两种鱼类Cyt b基因密码子第1位点上出现频率约等，在第2、3位点上的出现频率则存在明显差异。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因密码子第3位点上的变异频率显著高于第1和第2位点，但第3位点上的变异多为同义突变。【结论】都柳江鲇种群大小稳定，具有较丰富的遗传多样性；都柳江斑鳠种群遗传多样性较匮乏，可能经历过瓶颈效应和种群扩张事件，急需开展种群保护和恢复工作。

关键词： 鲇；斑鳠；Cyt b基因；遗传多样性；都柳江

中图分类号： S917；Q959.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1766-06

0 引言

【研究意义】鲇（Silurus asotus）、斑鳠（Hemibagrus guttatus）为我国重要淡水经济鱼类，分别隶属于鲇形目（Siluriformes）的鲇科（Siluridae）和鲿科（Bagridae）。鲇在我国各大水系均有分布（除新疆和西藏外）；斑鳠主要分布于钱塘江、九龙江和珠江等水系（褚新洛等，1999），因其肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺等优点，被视为珠江四大名鱼之一（陈焜慈等，1999）。都柳江位于贵州境内，为珠江水系西江中游支流——柳江的源流。近年来，因鲇和斑鳠的市场需求量不断增大，在都柳江受到高强度捕捞，其野生资源遭受严重破坏。因此，深入研究都柳江鲇、斑鳠种群遗传多样性及其分布现状，对开展这两种鱼类野生种群资源的利用与保护具有重要意义。【前人研究进展】DNA分子标记是鱼类遗传多样性研究的有效手段（Liu and Cordes，2004），可为制定鱼类种质资源的利用与保护策略提供参考依据。线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）为核外基因，具有母系遗传的特点，因其复制过程中缺乏修复机制而导致其序列的累积变异速率远高于核基因组的变异速率，现已成为群体遗传学研究中的理想分子标记（Saccone et al.，1991）。细胞色素b基因（Cyt b）是mtDNA中结构和功能研究较清楚的编码基因之一，其进化速度适中，适用于种群遗传多样性检测，现已在鱼类种群遗传多样性研究中得到广泛应用（Meyer and Wilson，1990；徐宇等，2015）。杜民等（2009）基于Cyt b基因序列探讨我国南海裸胸鳝属（Gymnothorax）鱼类系统发育关系，结果发现除蠕纹裸胸鳝（Gymnothorax kidako）来源于日本海外，其余5种裸胸鳝均来源于我国南海，但彼此间并无明显的地域差异。肖明松等（2013）对淮河鲇的7个野生种群Cyt b基因进行测定，结果表明，淮河鲇野生种群的遗传多样性较高，且各种群间未发生明显的地理分化。钟立强等（2013）对长江中下游5个湖泊的黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）种群Cyt b基因进行分析，结果表明，5个群体间遗传分化系数Fst为0.0684，几乎所有变异均来自群体内，群体间遗传分化极小，即长江中下游不同黄颡鱼种群尚未分化成不同的分支谱系，种群间存在广泛的基因交流。徐丹丹（2013）对鲇的长江、珠江、辽河及东南沿海等8个不同地理种群Cyt b基因进行分析，结果显示这8个地理种群尚保存着较丰富的遗传多样性。李大命等（2015）以Cyt b为分子标记对太湖大银鱼（Protosalanx chinensis）野生群体进行遗传多样性分析，结果表明太湖大银鱼种群稳定，尚未经历种群扩张。【本研究切入点】目前，贵州都柳江鲇、斑鳠野生资源正遭受过度捕捞，开展其野生种群保护及种质资源遗传多样性评估十分迫切，但至今鲜见有关贵州都柳江鲇、斑鳠野生种群遗传多样性的研究报道。【拟解决的关键问题】通过对贵州都柳江鲇、斑鳠的Cyt b基因序列进行测定分析，研究其种群的遗传多样性，为都柳江鲇形目经济鱼类的资源保护和开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

于都柳江干流上、中、下游的独山、三都、榕江和从江分别收集野生鲇、斑鳠各39尾鲜活个体。每尾活鱼取背部肌肉3.0～5.0 g，以无水乙醇固定后及时带回实验室，-20 ℃保存备用。

1. 2 DNA提取

采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取试剂盒，参照其说明从肌肉样品提取基因组DNA。DNA的质量和纯度用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20 ℃保存备用。

1. 3 Cyt b基因扩增与测序

用于扩增鲇、斑鳠Cyt b基因片段的引物为通用引物L14724（5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3'）和H15915（5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'）（Xiao et al.，2001），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系25.0 μL，包括2×Ex Taq Bufffer 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序参照肖明松等（2013）的方法。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，将电泳条带清晰、明亮且单一的产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序、拼接，测序引物为扩增引物。

1. 4 数据处理

序列输入ClustalX 2.1进行比对分析，辅以人工校对，获取长度相同的同源序列用于种群遗传多样性分析。用DnsSP 5.10计算遗传多样性参数，采用MEGA 5.0分析序列碱基含量及Kimura 2-parameter遗传距离，并将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。分别以大口鲇（Silurus meridionalis）Cyt b基因的同源序列（登录号JX087350.1）、大鳍鳠（Hemibagrus macropterus）Cyt b基因的同源序列（登录号JF834542.1）为外类群，构建鲇、斑鳠单倍型的系统发育进化树。同时采用Arlequin Ver. 3.01进行都柳江鲇、斑鳠种群的Tajimas D中性检验。

2 结果与分析

2. 1 都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因的序列组成及变异情况

PCR扩增获得的都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因序列长度均为1122 bp，然后分别进行遗传多样性分析研究。从39个鲇样本中共检测出11个单倍型，即NHap1～ NHap11（表1）。其中，NHap2为优势单倍型，其个体数占总个体数的58.97%，其次是NHap4，占总个体数的10.26%。从39个斑鳠样本中共检测出10个单倍型，即BHap1～BHap10（表2），其中以BHap2和BHap1为优势单倍型，分别占总个体数的61.54%和12.82%。

鲇Cyt b基因序列碱基T、C、A、G的平均含量分别为28.4%、29.9%、27.7%和14.0%，且A+T的平均含量（56.1%）明显高于C+G的平均含量（43.9%），表现出较强的少G偏倚性。鲇Cyt b基因共编码374个氨基酸，包含20种氨基酸。其中，亮氨酸的平均含量最高（17.65%），半胱氨酸的平均含量最低（0.80%）。4种碱基在氨基酸密码子3个位点的出现频率存在明显差异（表3），其中，在密码子第1位点上无明显的碱基偏倚性，第2位点上存在明显的T偏倚和反G偏倚，第3位点上存在反G偏倚且显示明显的A和C偏倚。鲇Cyt b基因序列中共检测到46个变异位点（表1），变异位点数占总位点数（1122）的4.1%。其中，简约信息位点38个，单一变异位点8个，未检测到插入或缺失位点；转换位点43个（C→T，26个；A→G，17个），颠换位点3个（T→G、C→A及T→A各1个），平均转颠換比为14.33，转换位点数明显多于颠换位点数。变异位点主要发生在密码子第3位点上（35/46），其次是第1位点（8/46）和第2位点（3/46）。

都柳江斑鳠种群Cyt b基因序列亦编码374个氨基酸，包含20种氨基酸。20种氨基酸平均含量存在明显差异，其中以亮氨酸平均含量最高（16.58%）、半胱氨酸平均含量最低（0.78%）。斑鳠Cyt b基因序列中碱基T、C、A、G的平均含量分别为31.8%、25.8%、29.3%和13.1%，A+T的平均含量（61.1%）也明显高于C+G的平均含量（38.9%）。由表3可知，斑鳠4种碱基在其氨基酸密码子第1、2位点上的分布特征与鲇相似，但在密码子第3位点上的反G偏倚（2.7%）和A偏倚（42.8%）更明显。斑鳠Cyt b基因序列存在15个变异位点（表2），变异位点数占总位点数（1122）的1.34%。其中，单一变异位点12个，简约信息位点3个，未检测到插入或缺失位点；转换位点7个（C→T，2个；A→G，5个），颠换位点8个（C→G，4个；T→A，3个；T→G，1个），平均转颠换比为0.86。变异位点数在密码子第3位点上最多（9个），在第1和第2位点上分别有4和2个变异位点。

2. 2 都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因编码氨基酸序列的变异情况

将都柳江鲇种群Cyt b基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，发现基于单倍型NHap2编码的氨基酸序列共检测到8个氨基酸变异位点。其中，由密码子第1位点碱基突变引起的氨基酸变异位点有5个，分别是：第11位天冬酰胺突变为天冬氨酸（Asn→Asp），第12位丙氨酸突变为苏氨酸（Ala→Thr），第93位缬氨酸突变为异亮氨酸（Val→Ile），第253位脯氨酸突变为丝氨酸（Pro→Ser），第374位苯丙氨酸突变为缬氨酸（Phe→Val）。由密码子第2位点碱基突变引起的氨基酸变异位点有3个，分别是：第19位脯氨酸突变为谷氨酰胺（Pro→Gln），第322位异亮氨酸突变为苏氨酸（Ile→Thr），第343位缬氨酸突变为丙氨酸（Val→Ala）。由密码子第1、2位碱基同时发生突变引起的氨基酸变异位点有1个，发生在第322位上，密码子由ATC变为GCC，引起异亮氨酸突变为丙氨酸（Ile→Ala）。密码子第3位点上的突变未引起氨基酸变异，属同义突变。

在斑鳠Cyt b基因编码的氨基酸序列中，基于单倍型BHap2编码的氨基酸序列仅检出了6个氨基酸变异位点。其中，由密码子第1位点碱基突变引起的氨基酸变异位点有3个，分别是：第364位甘氨酸突变为丝氨酸（Gly→Ser），第366位和第371位均为亮氨酸突变为缬氨酸（Leu→Val）。由密码子第2位点碱基突变引起的氨基酸变异位点有2个，为第17位丙氨酸突变为甘氨酸（Ala→Gly）和第64位半胱氨酸突变为酪氨酸（Cys→Tyr）。由密码子第3位点碱基突变引起的氨基酸变异仅1个，即第356位苯丙氨酸突变为亮氨酸（Phe→Leu）。

2. 3 都柳江鲇、斑鳠种群的遗传多样性

由表4可看出，都柳江鲇种群的各项遗传多样性参数均高于斑鳠种群，表现出相对较丰富的遗传多样性。鲇种群11个单倍型间的遗传距离为0.0009～ 0.0322，平均遗传距离为0.0163。斑鳠10个单倍型间的遗传距离为0.0009～0.0081，平均遗传距离为0.0030。可见，斑鳠种群个体间的遗传分化程度较鲇种群低。

根据遗传距离构建的系统发育进化树显示，都柳江鲇11个单倍型可分为两大分支（Gp1和Gp2）。其中，Gp2包括8个单倍型，代表34个个体，为优势分支，包含由NHap1、NHap3、NHap4聚成的小分支和由NHap2、NHap6、NHap9、NHap10、NHap11聚成的小分支；Gp1由3个单倍型组成，代表5个个体（图1）。斑鳠的10个单倍型也分为两大分支，其中一个分支由9个单倍型（BHap1～BHap8和BHap10）组成，代表38个个体，为优势分支；另一分支仅有1个单倍型（BHap9），代表1个个体（图2）。

2. 4 都柳江鲇、斑鳠种群的Tajimas D中性检验结果

Tajimas D中性检验结果表明，都柳江鲇种群Tajimas D为-0.25965，未达显著水平（P>0.05）；都柳江斑鳠种群Tajimas D为-2.18396，达极显著水平（P<0.01）。

3 讨论

Avise（2000）认为4种核苷酸在基因组中分布不均一是动物线粒体基因组的共性。都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因的1122 bp序列碱基组成相似，即4种碱基平均含量均存在差异，且A+T的平均含量高于G+C的平均含量，以G含量最低，符合鲇形目鱼类Cyt b基因碱基组成的特点（彭作刚等，2005；徐丹丹，2013）。Cyt b基因为蛋白质编码基因，其基因序列可通过密码子转译为蛋白质氨基酸序列。本研究发现，在都柳江鲇、斑鳠Cyt b基因中，4种碱基在密码子第1、2位点上的出现频率相似，但在密码子第3位点上，除了均存在反G偏倚外，鲇Cyt b基因存在明显的A（38.5%）和C（38.2%）偏倚，斑鳠Cyt b基因则表现出更明显的A偏倚（42.8%）。与之相似，竹荚鱼Cyt b基因密码子第3位点存在明显的C偏倚和反G偏倚（牛素芳等，2011），滁州鲫Cyt b基因密码子第3位点存在明显的T偏倚和反G偏倚（胡玉婷等，2015）。但关于Cyt b基因密码子第3位点上碱基出现频率的种间差异究竟是源于功能需要还是自然选择压力尚无定论。

编码蛋白质的基因常因蛋白质功能的需要和氨基酸三联密码子结构的限制，插入/缺失很少发生或发生后很容易被自然选择所淘汰（单云晶等，2013）。本研究结果表明，都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因均未发现插入或缺失，其变异表现为碱基替换，且多发生在密码子第3位点上，密码子第1、2位点变异较少；但Cyt b基因核苷酸序列结合其编码氨基酸序列分析结果显示，都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因编码氨基酸的变异主要源于其密码子第1、2位点上的碱基变异，而密码子第3位点上的碱基替换仅导致氨基酸序列中的1个位点氨基酸发生变异。说明都柳江鲇、斑鳠种群Cyt b基因密码子第1、2位点变异率虽然较低，但其变异常导致其编码蛋白质的氨基酸变异；密码子第3位点由于受自然选择的压力较小，其变异率较高，但多为同义突变，与张艳云等（2011）对闭壳龟类的研究结果一致。

衡量物种种群遗传多样性的两个重要指标是单倍型多样性和核苷酸多样性，其中核苷酸多样性比单倍型多样性更可靠，主要是因为前者考虑了各种mtDNA单倍型在种群中的比例（李玉芳等，2014）。本研究中，都柳江鲇种群单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数均高于斑鳠种群，说明都柳江鲇种群的遗传多样性较斑鳠种群更丰富。Grant和Bowen（1998）根据单倍型多样性和核苷酸多樣性，将鱼类种群分为4种类型：（1）较低的单倍型多样性和低的核苷酸多样性，表明种群近期发生了瓶颈效应或由单一、少数系群发生了奠基者效应；（2）较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，显示种群经历瓶颈效应后发生了快速扩张，但累积的核苷酸突变尚少；（3）较低的单倍型多样性和较高的核苷酸多样性，意味着种群来源于两个独立的地理群体发生第二次接触或由一个之前大而稳定的种群发生了严重的瓶颈效应所致；（4）较高的单倍型多样性和高的核苷酸多样性，说明种群可能由一个大而稳定的种群经历较长的历史演化或由两个不同系群发生二次接触所致。本研究中，都柳江鲇种群具有较高的单倍型多样性和核苷酸多样性，属于第4种类型，推测该种群由一个大而稳定的种群演化所产生； 都柳江斑鳠种群具有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，符合第二种类型，表明该种群可能在经历瓶颈效应后发生了快速扩张，其单倍型多样性快速增加但累积的核苷酸多样性仍较低（Avise，2000）。

Tajimas D中性检验常用于推测种群曾经过的历史事件，当Tajimas D为负值且统计学上达显著性水平时，表明该种群在过去经历了扩张事件，反之则群体大小趋于稳定（Meyer and Wilson，1990）。本研究中，都柳江鲇种群Tajimas D为-0.25965，但未达显著水平（P>0.05），表明该种群大小趋于稳定；都柳江斑鳠种群Tajimas D为-2.18396且达极显著水平（P<0.01），即都柳江斑鳠种群可能经历过种群扩张事件。

4 结论

都柳江鲇种群大小稳定，具有较丰富的遗传多样性；都柳江斑鳠种群遗传多样性较匮乏，可能经历过瓶颈效应和种群扩张事件，急需开展种群保护和恢复工作。

致谢：感谢贵州大学动物科学学院动物分子生物学实验室曾智勇教授对本研究中分子生物学实验的指导和帮助。

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（责任编辑 兰宗宝）