牛角瓜大孢子与小孢子的发生发育观察

宾珍兰 汤丹峰 郑杰 刘一丁 陈励虹 周瑞阳

摘要：【目的】明确牛角瓜[Calotropis gigantea（Linn.） W. T. Aition]大孢子与小孢子的发生发育情况，为其耕作栽培学及植物学研究提供基础资料，也为其遗传育种研究及品种改良打下基础。【方法】于盛花期采集不同发育时期的牛角瓜花蕾，运用石蜡切片技术观察其大孢子与小孢子的发生发育特征。【结果】牛角瓜大孢子与小孢子的发育时期与其花器官外部形态特征存在对应关系，雄蕊的发生发育早于雌蕊。牛角瓜小孢子黏连成块状结构，与普通植物的分散型小孢子形成鲜明对比，其小孢子母细胞发育为连续型，绒毡层细胞有3～4层，为腺质绒毡层，单核期绒毡层细胞壁开始降解，花粉成熟后绒毡层细胞自溶。胚囊发育类型为蓼型，胚珠横生，无珠被；四分体呈线型排列，成熟胚囊有次生核。【结论】牛角瓜大、小孢子发生及雌、雄配子体发育与花器官外部形态大小密切相关，其结实率低并非雌性或雄性败育所致。

关键词： 牛角瓜；花粉块；大孢子；小孢子；发生发育特征

中图分类号： S567.239 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1658-06

0 引言

【研究意义】牛角瓜[Calotropis gigantea（Linn.） W. T. Aition]又名断肠草、五狗卧花，属萝藦科常绿灌木，树高可达3.0 m，全株富含乳汁，自然分布于热带和南亚热带地区，可在干热河谷、沙漠化、盐碱地、沙滩等荒地推广种植。牛角瓜是一味传统中药，富含牛角瓜苷、强心苷和生物碱等有效成分，具有强心镇痛、抗菌消炎、抗癌等作用。牛角瓜纤维是牛角瓜种子上生长的附属物，平均长度34.0 mm，是近年来发现的一种新型可利用的植物纤维（方国平和胡惠民，2014），但牛角瓜存在大量落花现象，受精结实率极低，其纤维产量一般仅有75 kg/ha左右。因此，明确牛角瓜的生殖生长规律是其品种改良和高产栽培技术研究的关键。【前人研究进展】至今，已有较多关于牛角瓜纤维的研究报道。黄惠民（2009）通过对牛角瓜纤维进行特殊处理，最终得到可纺纤维，开启了人们对牛角瓜利用的新认识，即牛角瓜纤维可作为一种新型的纺织原料。费魏鹤等（2011）对牛角瓜纤维结构进行扫描电镜观察，发现其具有纤维表面光泽度好、中空度大等显著特点。高静等（2013）对牛角瓜纤维的结构、性能进行测试，并与木棉、棉花纤维比较，认为牛角瓜纤维中空度高、相对密度小、色泽光亮、手感柔滑，是制作保暖、高档纺织品的新型材料。李璇等（2013）研究发现，牛角瓜纤维纵向和横截面形态特征显著，且纤维密度较小，红外吸收光谱图有特征峰，可区别于其他纤维。目前，牛角瓜主要采用播种繁殖。高柱等（2014）研究发现，水浸催芽可提高牛角瓜种子萌发率，且秋季播种发芽率较春季高；刘鹏等（2014）研究表明，各施肥水平对牛角瓜苗高和地径生长作用明显，各营养元素对牛角瓜苗高、地径生长的影响排序为N>P>K。牛角瓜开花数量多，但坐果率低，且产量低（魏静等，2013），極大制约了牛角瓜纤维的开发与利用。【本研究切入点】一般来说，影响植物结实率的因素诸多，主要包括外在环境因素和自身生殖特性因素两大类。外部环境因素包含温度、光照、水分、病虫害等，自身生殖特性又分为有性生殖发育特性和传粉生物学特性（何长征等，2008；周建梅等，2016）。在特定的外部环境条件下，了解其生殖生长情况，有助于找出结实率低的原因，为其品种改良、品种质量和产量提高提供理论依据，但至今鲜见有关牛角瓜生殖生长方面的研究报道。【拟解决的关键问题】明确牛角瓜大、小孢子发生及雌、雄配子体发育与花器官外部形态大小的关系及其发育特征，为牛角瓜的耕作栽培学及植物学研究提供基础资料，也为其遗传育种研究及品种改良打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

牛角瓜由广西药用植物园提供，种植于广西大学农学院教学科研基地。

1. 2 试验方法

于盛花期采集不同发育时期的花蕾，去除花冠，用游标卡尺按柱头部位（包含柱头与副花冠）大小进行分级取样，图1为白色花测量方式。不同分级各取10朵花蕾，用FAA固定液固定20 h后转入70%乙醇，放入4 ℃冰箱保存备用。固定材料经70%、80%、85%、90%、95%和100%梯度酒精脱水后，TO透明剂透明、透蜡、包埋、切片（厚度10 μm），再以TO透明剂脱蜡、海氏苏木精染色5 min、树胶封片，Olympus BH-2型光学显微镜下观察与摄影。

2 结果与分析

2. 1 雌、雄配子体发育时期与花器官外部形态特征的关系

牛角瓜花为两性花，由形状如小狗的五枚副花冠环绕柱头，故又名五狗卧花，花药绕生于柱头周边（图1箭头所示处），雄蕊的发生发育早于雌蕊，雄蕊发育的同时副花冠也在生长，副花冠与柱头相对位置的变化见表1，其颜色发生变化，由白色渐变为浅紫色到紫色（图1），雄蕊成熟时花冠未开展。花冠开展后即成熟胚囊形成。

2. 2 小孢子发生与雄配子体的发育规律

小孢子母细胞比周围的花粉囊壁细胞大，其细胞质浓厚，细胞核大，核仁明显（图2-a），且不同切面呈不同状态（图2-b），之后小孢子母细胞体积继续增大，进入减数分裂时期，可观察到二分体、四分体结构分布在整个花粉囊室内（图2-c），随后进入单核期（图2-d），绒毡层细胞有3～4层，其细胞壁在单核靠边期开始降解，小孢子间存在某种物质能促使小孢子聚集成块（图2-e），在花粉成熟后绒毡层细胞自溶（图2-f），成熟花粉粒排列紧凑，形状各异，呈明显的棱角状（图2-g）。

牛角瓜一般有4～5个花药，每个花药有两个花粉囊，每个花粉囊形成1～2个花粉块，多为1个。两个相连花粉囊的花粉块通过花粉块柄连在一起（图2-h），如昆虫翅膀状（图2-i）。花药开裂处位于花粉块柄生成处（图2-h），花粉块长约1.2 mm。

2. 3 大孢子发生与雌配子体发育规律

2. 3. 1 大孢子的发生 牛角瓜花有两枚心皮，离生（图3-a）。子房腹缝线内表皮局部细胞进行平周分裂和垂周分裂，形成突起，即胚珠原基，其胎座类型为边缘胎座（图3-b）。胚珠原基细胞经分裂和分化后，朝向胎座的一端发育为珠柄，另一端发育为珠心组织。此时的珠心组织细胞分裂能力较强，且上端细胞的分裂速度与下端细胞分裂速度相同，胚珠直线生长。同时，珠心表皮下出现一个体积与细胞核皆比周围珠心组织细胞大的细胞，即孢原细胞（图3-c），孢原细胞开始分裂形成一个在纵轴方向明显伸长的细胞，即大孢子母细胞。珠心表皮细胞与大孢子母细胞间含有2～3层细胞，即牛角瓜大孢子发育属于厚珠心型（图3-d）。随后大孢子母细胞进入减数分裂时期，经过第一次分裂产生二分体细胞（图3-e），在此过程中胚珠各部位珠心组织细胞分裂速度并不一致，珠柄开始出现弯曲，随后大孢子母细胞进入第二次分裂，产生4个大孢子，沿胚珠长轴方向排列形成线性四分体（图3-f）。

2. 3. 2 雌配子体的发育 四分体形成后不久，珠孔端的3个大孢子会逐渐退化，近珠柄端的大孢子发育形成功能大孢子（图4-a）。功能大孢子进行一次细胞内核分裂，产生2个细胞核，即形成二核胚囊。2个细胞核间形成一个大液泡，使2个细胞核分别向胚囊的两极移动（图4-b）。2个细胞核分别在胚囊的两端进行两次核分裂，形成八核胚囊（图4-c），之后两极端各有一个细胞核向胚囊中间移动，形成中央细胞的极核，2个极核再进一步融合形成次生核（图4-d），远珠柄端剩余3个细胞核分别形成一个卵细胞和2个助细胞（图4-d），而近珠柄端的3个细胞核形成反足细胞（图4-e）。因此，牛角瓜雌配子体发育属于蓼型。雌配子体发育过程中珠柄继续弯曲，最后成熟胚珠为横生胚珠（图4-e），整个胚囊的发育过程未见珠被结构。

3 讨论

绒毡层是花药壁的最内层，对花粉的发育起着重要作用。绒毡层通常为一层，少数植物为二层或多层，牛角瓜绒毡层为3～4层，与春兰（Cymbidium goeringii）花药壁为二层相似（胡适宜和杨坚，1989），可能与花粉块的形成有关。腺质绒毡层或称分泌绒毡层，在花药发育过程中腺质绒毡层细胞壁自溶后所产生的原生质体仍然能不同程度地维持原形，直到花粉成熟后，原生质体完全自溶（武阿梅等，2008；肖玉菲等，2014）。原生质体完全自溶前，首先是细胞壁溶解，在不同植物中细胞壁溶解的时期并不一致，番茄（Lycopersion esculentum）的细胞壁溶解是在小孢子母细胞时期（陈国菊等，1999），楸树（Catalpa bungei）在四分体后才溶解（樊莉丽等，2011），虎榛子（Ostryopsis davidiana）在单核小孢子时期开始溶解（武阿梅等，2008）。本研究中，牛角瓜绒毡层为腺质绒毡层，细胞壁溶解发生在单核期。

通常情况下，被子植物的小孢子在四分体形成后胼胝质会消失，小孢子单粒散落，如烟草（Nicotiana rustica）（朱楠等，2014）、柴胡（Bupleurum Chinese）（王艳杰和申家恒，2007）、虎榛子（武阿梅等，2008）等，也有以四分体为单位的四合花粉，如春兰（胡适宜和杨坚，1989）等。本研究中，牛角瓜花粉粒为无规则聚集形成花粉块，且成熟花粉块内花粉粒壁厚度不一，与高斑叶兰（Goodyera procera）（徐是雄等，1987）、春兰（胡适宜和杨坚，1989）等兰科植物相似。胡适宜和杨坚（1989）研究发现，在兰科植物花粉块形成过程中，其花粉块成分含有孢粉素和纤维素，是由于四分体间有胞间连丝，存在联结花粉粒的桥结构，或由花粉粒外壁的纤维状物质黏合作用而形成。至于牛角瓜花粉块内连接小孢子与小孢子间的物质成分是什么，以及花粉粒间是如何作用形成花粉块等问题，均需进一步探究。

整个牛角瓜胚囊发育过程未见珠被结构，属于无珠被胚珠。此外，牛角瓜小孢子与大孢子发育过程正常，未发现败育现象，说明其结实率低与雌性或雄性不育无关，可能与花粉结构或传粉生物学特性有关，具体机理有待深入研究。

4 结论

牛角瓜大、小孢子發生及雌、雄配子体发育与花器官外部形态大小密切相关，其结实率低并非雌性或雄性败育所致。

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（责任编辑 兰宗宝）