长叶竹柏次生代谢产物及其抗细菌活性

伍慧雄 秦楷 张伟豪 罗元嘉 孙朝辉 王军 单体江

摘要：【目的】分析和鑒定长叶竹柏叶片和枝条挥发油的化学组成，测定长叶竹柏叶片和枝条挥发油及其甲醇提取物对7种供试细菌的抑制活性，为长叶竹柏资源的开发利用提供参考。【方法】采用水蒸气蒸馏法分别提取长叶竹柏叶片和枝条的挥发油，通过气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）对提取得到的挥发油进行化学成分分析，采用峰面积归一化法测定各化学成分的相对百分含量，并以抑菌圈法和薄层层析—生物自显影法分别测定长叶竹柏枝叶挥发油和甲醇提取物对供试细菌的抑制活性。【结果】长叶竹柏叶片和枝条挥发油的得率分别为0.104%和0.078%。从长叶竹柏叶片挥发油中鉴定出45种成分，占挥发性成分总量的92.63%，主要成分为（1R）-α-蒎烯（34.50%）、大根香叶烯B（22.82%）、大根香叶烯D（5.46%）、绿花烯（4.74%）和α-古芸烯（3.15%）；从长叶竹柏枝条挥发油中鉴定出44种成分，占挥发性成分总量的95.51%，主要成分为（1R）-α-蒎烯（43.86%）、δ-杜松烯（7.93%）、1-石竹烯（4.92%）、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1H-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）、古巴烯（3.68%）、γ-杜松烯（3.60%）和蒜头环烯（3.04%）。长叶竹柏叶片和枝条挥发油对供试细菌表现出一定的抑制活性，但差异不明显；长叶竹柏叶片挥发油对根癌土壤杆菌的抑制活性最强，抑菌圈直径为9.0±0.0 mm，而枝条挥发油对溶血葡萄球菌和黄瓜角斑病菌的抑制活性最强，抑菌圈直径均为8.3±0.6 mm。除桉树青枯病菌外，长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物对其余6种供试细菌均表现出较好的抑制活性，其中叶片甲醇提取物对供试细菌的抑制活性强于枝条。【结论】长叶竹柏叶片和枝条中的抗菌活性物质主要为非挥发性的物质，可作为天然抗菌活性物质资源开发利用。

关键词： 长叶竹柏；挥发油；化学成分；GC-MS；抗菌活性

中图分类号： S482.2；S791.46 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1867-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze and identify the chemical composition of the volatile oils extracted in leaves and branches of Podocarpus fleuryi Hickel. The antibacterial activities of the volatile oils and methanol extracts were tested against seven different bacteria. This study would provide the potential foundation for the development and utilization of P. fleuryi resources. 【Method】The volatile oils were extracted by hydro-distillation from leaves and branches of P. fleuryi and the chemical compositions of the essential oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. The relative percentages of different chemical components were measured by peak area normalization. Inhibition zone method and TLC-MTT-bioautography were used to detect the inhibitory activities of volatile oils extracted from leaves and branches of P. fleuryi and methanol extracts against the tested bacteria. 【Result】The yields of volatile oils in leaves and branches were 0.104% and 0.078%， respectively. Forty-five components were identified from the volatile oils in leaves， accounting for 92.63% of total volatile components. The major constituents included（1R）-α-pinene（34.50%）， germacrene B（22.82%）， germacrene D（5.46%）， viridiflorene（4.74%） and α-gurjunene（3.15%）. Forty-four components were identified from the volatile oils in branches， accounting for 95.51% of total volatile components. The major constituents included（1R）-α-pinene（43.86%）， δ-cadinene（7.93%）， l-caryophyllene（4.92%），（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1H-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）， 2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）， copaene（3.68%）， γ-cadinene（3.60%） and cyclosativene（3.04%）. The volatile oils in leaves and branches showed certain inhibitory activities to the tested bacteria， but the differences were not obvious. The volatile oil in leaves showed the strongest inhibitory activity against Agrobacterium tumefaciens and the inhibition zone diameter was 9.0±0.0 mm. While the branches volatile oil showed strongest inhibitory activities against Staphylococcus haemolyticus and Pseudomonas syringae， and inhibition zone diameters were both 8.3±0.6 mm. The methanol extracts from the leaves and branches showed sound inhibitory activity to the tested bacteria except for Ralstonia solanacearum， and the inhibitory activities of methanol extracts from leaves was stronger than that of methanol extracts from branches. 【Conclusion】The antibacterial substances in leaves and branches of P. fleuryi Hickel are mainly non-volatile substances， and can be developed as natural antibacterial substance resources.

Key words： Podocarpus fleuryi Hickel； volatile oil； chemical constituent； GC-MS； antibacterial activity

0 引言

【研究意义】长叶竹柏（Podocarpus fleuryi Hickel）为罗汉松科竹柏属常绿乔木，又名桐木树、竹叶球等，生于海拔800～900 m的山地林中，主要分布于我国的云南东南部、广西、广东、海南和台湾等地。其木材结构致密，为上等的家具、建筑用材；种子含油较丰富，经济价值较高；树形优美，常作行道树及园林绿化树种（何道航等，2005； 张兰春，2013）。长叶竹柏作为常见的园林绿化树种很少受病虫为害，是否与自身产生的抗菌活性物质有关值得深入研究和探讨。【前人研究进展】目前，国内外有关长叶竹柏的研究较少且主要集中于叶片化合物成分和植株抗逆研究（齐代华等，2003a， 2003b）。徐亚明等（1990）根据理化性质和波谱学方法从长叶竹柏枝叶中鉴定出棕搁酸、柳杉酚等11种成分，但未给出相关数据。何道航等（2005）采用水蒸气蒸馏法提取长叶竹柏叶片中的挥发油，通过气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）分析，共鉴定出24种化合物，其中主要成分为4-isopropylidene-1-vinyl-o-

Menth-8-ene（45.13%）、大根香葉烯（21.56%）、α-蒎烯（8.67%）、β-石竹烯（3.97%）、（-）-斯巴醇（3.15%）、（-）-β-榄香烯（2.68%）、（+）-喇叭烯（2.11%）和β-杜松烯（2.02%）。杜红光（2008）采用水蒸气蒸馏法分别提取竹柏和长叶竹柏叶片中的挥发油，通过GC-MS分析，分别鉴定出13和29种化合物，主要成分为萜烯类和醇类物质，但两者挥发油GC-MS分析图谱和成分存在明显差异。刘娟（2015）对云南西双版纳的长叶竹柏叶片和枝干的化学成分进行分离和鉴定，共分离鉴定获得39种化合物，其中2种为新的甾体化合物；对分离获得到的新甾体类化合物进行了细胞毒活性研究，但未表现出活性。目前已有长叶竹柏同属植物竹柏叶片及枝条中挥发油的相关研究报道。胡文杰等（2014）用水蒸气蒸馏法和GC-MS分析对竹柏叶片及其枝条中挥发油进行分析，从竹柏叶片和枝条挥发油中各检测出36 和43种成分，共检测出52种物质；竹柏叶片及其枝条挥发油中共有成分27种，但相对含量不同，如叶片中α-蒎烯含量为3.89%，而在枝条中的含量为20.77%。【本研究切入点】长叶竹柏资源丰富，但尚未见其不同部位挥发油化学成分分析及其抗细菌活性的报道。【拟解决的关键问题】采用水蒸气蒸馏法提取长叶竹柏叶片和枝条中的挥发油，运用GC-MS分析其挥发油的化学组成并通过抑菌圈法测定其抗细菌活性，以确定长叶竹柏不同部位挥发油的化学成分及相对含量，并探索其抑菌活性；采用薄层层析—生物自显影法（TLC-生物自显影）分别测定长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物对供试细菌的抑制活性，以期为长叶竹柏在农林业上的应用提供新思路。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

长叶竹柏枝条和叶片于2014年7月18日采自华南农业大学树木园，植株生长状态良好，无病虫为害。标本由华南农业大学林学与风景园林学院郑明轩老师鉴定。供试细菌包括5种革兰氏阴性菌和2种革兰氏阳性菌，分别为根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens，G-）、大肠杆菌（Escherichia coli，G-）、桉树青枯病菌（Ralstonia solanacearum，G-）、黄瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans，G-）、番茄疮痂病菌（Xantho-

monas vesicatoria，G-）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，G+）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+），均由华南农业大学林学与风景园林学院森林保护教研室提供。

主要试剂：硫酸链霉素（美国Sigma公司）；C8～C40系列正构烷烃（美国Sigma公司）；噻唑兰（MTT）（美国Amresco公司）；氯化钠、无水乙醚、无水硫酸钠、正己烷等均为国产分析纯（北京化学试剂公司）。主要仪器设备：6890N-5975C气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）（美国安捷伦科技有限公司）；水蒸气蒸馏装置（北京永光明医疗仪器厂）；RE5298A型旋转蒸发器（上海亚荣仪器厂）等。

1. 2 长叶竹柏挥发油提取

参照Lou等（2014）的方法并作适当修改。分别采集长叶竹柏的叶片和枝条，剪碎、称重后装入水蒸气蒸馏装置内，加入适量蒸馏水，待温度升至100 ℃后连续蒸馏6 h，收集蒸出的精油，加入一定量的NaCl，用无水乙醚萃取3次，萃取液合并，加入无水硫酸钠进行干燥，让乙醚自然挥发，4 ℃密封保存。

1. 3 长叶竹柏叶片和枝条挥发油化学组分分析

长叶竹柏叶片和枝条挥发油化学组分鉴定在6890N-5975C GC-MS上进行，色谱柱为DB-5（30 m×250 μm×0.25 μm），无分流进样，进样口温度230 ℃，进样量1 μL。升温程序：起始温度70 ℃，保持1 min；8 ℃/min上升到120 ℃，保持1 min；30 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min；5 ℃/min上升到175 ℃，保持0 min；1 ℃/min上升到180 ℃，保持0 min；5 ℃/min上升到240 ℃，保持0 min。电离方式为EI，电离能量70 eV，载气为He，流速1 mL/min，全扫描采集，质谱检测器（MSD）检测。通过NIST（2011）谱库检索，与标准化合物的保留时间和质谱图进行比对，确定待测成分。

1. 4 长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物制备

采用甲醇冷浸提取法分别提取长叶竹柏叶片和枝条中的次生代谢产物。分别将长叶竹柏的叶片和枝条剪碎，装入1000 mL三角瓶中，加入适量甲醇，室温下冷浸提取3次，每次7 d，浓缩提取液，水混悬后用乙酸乙酯连续萃取3次，浓缩萃取液即得到长叶竹柏叶片和枝条的甲醇提取物，4 ℃冷藏，备用。

1. 5 长叶竹柏次生代谢产物抗细菌活性测定

1. 5. 1 长叶竹柏叶片和枝条挥发油抗细菌活性测定 長叶竹柏叶片和枝条挥发油抗细菌活性测定参照赵文越等（2014）的方法并略有改进。供试细菌先用LB 培养基活化培养（28 ℃，暗）48 h，然后挑取单菌落在LB液体培养基中摇床培养（28 ℃，暗，150 r/min）24 h，将菌液浓度稀释至108 CFU/mL，备用。倒好培养基后，用移液枪分别吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂抹均匀。用灭菌镊子夹取无菌的滤纸片放在培养皿中，每皿放置3片，滤纸片间保持一定距离，然后分别在滤纸片上加入5 μL挥发油，阳性对照为5 μL硫酸链霉素（0.2 mg/mL），每处理3次重复。在黑暗条件下培养24 h后用尺子量取抑菌圈直径。

1. 5. 2 长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物抗细菌活性测定 长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物抗细菌活性测定参照Shan等（2012）的方法。将甲醇提取物溶解，用直径0.5 mm的毛细管点样，点样量为5 μL。采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行薄层层析，薄层层析后在薄层板的一侧原点处点5 μL硫酸链霉素（0.2 mg/mL）作阳性对照，备用。向灭菌的LB半固体培养基（琼脂浓度为0.5%）中加入一定量准备好的菌液（45 mL LB+5 mL菌液），将其浓度调至约108 CFU/mL，振荡、均匀。用喷样器将制备好的菌悬液均匀喷洒到层析后的硅胶板上；待培养基在硅胶板上冷却后，将硅胶板置于培养皿中于4 ℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的扩散；然后将培养皿置于28 ℃下保湿培养，12 h后取出硅胶板，在其上均匀喷洒噻唑蓝（MTT），约10 min后即可观察试验结果。有抗菌活性成分处，供试菌由于受到抑菌成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试菌正常生长，通过MTT显色后出现背景色蓝色。通过抗菌斑点的迁移率（Rf）初步评价样品中抗菌化合物的数量和极性，根据抗菌斑点的大小初步评价化合物的活性和含量

Rf=■

2 结果与分析

2. 1 长叶竹柏叶片和枝条挥发油化学成分分析结果

采用水蒸气蒸馏法提取长叶竹柏叶片和枝条中的挥发油，得率分别为0.104%和0.078%（以鲜重为基础），说明长叶竹柏叶片中挥发油的含量远高于枝条。采用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量，并对相对百分含量进行定量分析，结果见表1。长叶竹柏叶片和枝条挥发油总离子流图见图1和图2。通过GC-MS分析发现，长叶竹柏叶片和枝条挥发油在化学组成和相对含量上均存在明显差异。从长叶竹柏叶片中共鉴定出45种成分，占总相对含量的92.63%，主要成分是（1R）-α-蒎烯（34.50%）、大根香叶烯B（22.82%）、大根香叶烯D（5.46%）、绿花烯（4.74%）和α-古芸烯（3.15%），其相对含量之和为70.67%，其他成分相对含量均小于3.00%；在枝条中共鉴定出44种成分，占总相对含量的95.51%，其中主要成分是（1R）-α-蒎烯（43.86%）、δ-杜松烯（7.93%）、1-石竹烯（4.92%）、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（pro-

pan-2-yl）octahydro-1h-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）、古巴烯（3.68%）、γ-杜松烯（-）-γ-荜澄茄烯（3.60%）和蒜头环烯（3.04%），其相对含量之和为75.66%；其他成分相对含量均小于3.00%。

从表1可进一步看出，长叶竹柏叶片和枝条挥发油主要以萜烯类和醇类为主，二者的主要成分均为（1R）-α-蒎烯，其相对含量分别为34.50%和43.86%，（1R）-α-蒎烯在枝条中的相对含量比叶片高9.36%（绝对值）。此外，大根香叶烯B和大根香叶烯D在叶片挥发油中的相对含量高达22.82%和5.46%，但在枝条中未检测到；1-石竹烯、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene、古巴烯、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-

methyl-＼3-methy-lidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1h-

cyclopenta[1，3]、cyclopropa[1，2]benzene和蒜头环烯作为枝条挥发油的主要成分，在叶片中也未检测到。除（1R）-α-蒎烯外，长叶竹柏叶片和枝条挥发油中相同的成分还有11种，分别为1-辛烯-3-醇、β-水芹烯、α-古芸烯、α-石竹烯、绿花烯、γ-杜松烯、β-杜松烯、δ-杜松烯、naphthalene，1，2，3，4，4a，7-hexahydro-1，6-dimethyl-

4-（1-methylethyl）-、阿松香三烯和铁锈罗汉柏醇，但α-古芸烯、绿花烯和δ-杜松烯在叶片和枝条挥发油中的相对含量差别较明显。

通过以上分析可知，长叶竹柏叶片和枝条中均含有一定量的挥发油，虽然相对含量最高的成分均为（1R）-α-蒎烯，但不同部位的化学组成存在一定差异，因此要根据不同的需求，采集不同的部位进行提取。

2. 2 长叶竹柏次生代谢产物的抗细菌活性

2. 2. 1 长叶竹柏叶片和枝条挥发油的抗细菌活性 长叶竹柏叶片和枝条挥发油对7种供试细菌的抑制活性见图3。从图3可看出，长叶竹柏叶片和枝条挥发油对不同供试细菌的抑制活性差异不明显，但均弱于阳性对照硫酸链霉素，其中叶片挥发油对根癌土壤杆菌的抑制活性最强，抑菌圈直径为9.0±0.0 mm，而枝条挥发油对溶血葡萄球菌和黄瓜角斑病菌的抑制活性最强，抑菌圈直径均为8.3±0.6 mm。长叶竹柏叶片和枝条挥发油对大肠杆菌均未表现出任何抗菌活性。活性测定结果表明长叶竹柏叶片和枝条挥发油对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑制活性无明显规律性。

2 .2. 2 长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物的抗细菌活性 通过TLC-生物自显影法测定长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物的抗细菌活性，结果见表2。从表2可以看出，阳性对照硫酸链霉素对7种供试细菌的抑制活性与抑菌圈法测定的结果基本一致，对根癌土壤杆菌、番茄疮痂病菌和溶血葡萄球菌的抑制活性最强，抑菌圈直径均大于10 mm。长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物除对桉树青枯病菌在Rf为0.00～1.00的范圍内均未表现出抑菌活性外，对其余6种供试细菌均表现出较好的抑制活性，其中叶片甲醇提取物对供试细菌的抑制活性强于枝条。长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物对供试细菌的最大抑菌斑直径均在5～10 mm，但叶片甲醇提取物的抑菌斑多于枝条。以对根癌土壤杆菌的抑制活性为例，长叶竹柏叶片和枝条甲醇提取物在Rf为0.00～0.25的范围内均表现出抑制活性，叶片提取物在Rf为0.62～0.63的范围内表现出较弱的抑制活性，枝条在Rf为0.60～0.67的范围内也表现出相应的抑制活性；而叶片提取物在Rf为0.28～0.30和0.33～0.38的范围内抑菌斑直径在0～5 mm，枝条提取物在此范围内未表现出抑制活性。长叶竹柏叶片甲醇提取物对枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌和大肠杆菌的抑制活性与对根癌土壤杆菌的抑制活性一样，明显强于枝条甲醇提取物；对番茄疮痂病菌和黄瓜角斑病菌的抑制活性几乎与枝条提取物一致。综上所述，长叶竹柏的甲醇提取物对供试细菌具有一定的抑制活性，且叶片提取物的抑制活性强于枝条提取物。

3 讨论

自何道航等（2005）首次从长叶竹柏叶片挥发油中鉴定出24种成分以来，尚未见长叶竹柏枝条挥发油化学成分分析及长叶竹柏挥发油抗细菌活性的报道。本研究采用水蒸气蒸馏法分别提取长叶竹柏叶片和枝条中的挥发油，利用GC-MS从叶片挥发油中鉴定出45种成分，从枝条挥发油中鉴定出44种成分，首次阐明了长叶竹柏枝条挥发油的化学组成及其相对含量。长叶竹柏叶片和枝条挥发油虽然在化学组成和相对含量上存在明显差异，但最主要的成分均为（1R）-α-蒎烯，其在叶片和枝条中的相对含量分别为34.50%和43.86%。而何道航等（2005）用水蒸气蒸馏法提取长叶竹柏叶片中的挥发油，通过GC-MS分析共鉴定出24种化合物，其中主要成分为4-isopropylidene-1-vinyl-o-

Menth-8-ene（45.13%）和大根香叶烯（21.56%）等，α-蒎烯的相对含量仅占8.67%，低于本研究的34.50%，原因可能与植物生长的地理环境、采集时间以及提取和纯化方法等不同有关。胡文杰等（2014）研究发现竹柏叶片挥发油的主要成分为榄香烯（20.85%）、β-荜澄茄油烯（15.50%）、3-崖柏烯（8.61%）和α-石竹烯（5.86%），而竹柏枝条挥发油的主要成分为α-蒎烯（20.77%）、大根香叶烯B（15.12%）、石竹烯（9.30%）、β-荜澄茄油烯（8.07%）和δ-杜松烯（5.48%）。长叶竹柏和竹柏虽然同属于罗汉松科竹柏属，但挥发油的化学组成和相对含量差别较大。

长叶竹柏叶片挥发油中含量最多的α-蒎烯能合成樟脑酸酐和樟脑醌，具有杀虫和抑菌活性，也是许多种植物精油活性成分的重要组成部分（梁志华等，2013a，2013b；林立等，2015；吴恒等，2015）。α-蒎烯对白色念珠菌的生物合成有显著的抑制作用，其通过抑制白色念珠菌细胞膜中麦角固醇、胞壁中几丁质、多糖的合成及抑制核酸DNA、RNA 的合成而起到杀菌作用（夏忠弟和余俊龙，2000）。本研究首次报道了长叶竹柏叶片和枝条挥发油对不同供试细菌的抑制活性，结果表明，长叶竹柏枝叶挥发油对供试细菌的抑制活性不强，而长叶竹柏叶片和枝条的甲醇提取物表现出相对较强的抑制活性，可能与叶片和枝条中产生的非挥发性抗菌活性物质有关。徐亚明等（1990）、徐亚明和方圣鼎（1991）从长叶竹柏枝叶非挥发性成分中分离得到12种化合物，并经药理筛选试验发现有2个双内酯化合物对白血病细胞P388有显著的抑制作用；张春兰（2013）从云南西双版纳的长叶竹柏中分离得到具有较强细胞毒作用的二萜双内酯类化合物；但尚未见这些分离到的单体化合物对细菌抑制活性的报道。本研究结果表明，长叶竹柏枝叶甲醇提取物中确实存在抗菌活性化合物，这些抗菌物质是否为前人已分离到的单体化合物有待进一步研究。TLC-生物自显影法不仅可以快速灵敏地检测植物粗提物中的抗菌活性物质，还能通过薄层层析和Rf大小可对抗菌活性化合物的数目和极性有一定了解。

4 结论

长叶竹柏叶片和枝条中均含有种类丰富的挥发油，主要以萜烯类和醇类为主，其中叶片挥发油的含量高于枝条；除桉树青枯病菌外，长叶竹柏枝叶甲醇提取物对其余6种供试细菌均表现出较好的抑制活性，其中叶片甲醇提取物对供试细菌的抑制活性强于枝条，说明长叶竹柏中的抗菌活性物质主要为非挥发性物质。

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（責任编辑 麻小燕）