小菜蛾性信息素与性信息素结合蛋白、受体蛋白结合机理研究

李玉华 邓培渊 刘宇邈 雷志华

摘要：【目的】研究小菜蛾性信息素与性信息素结合蛋白、受体蛋白之间作用的关键氨基酸残基和作用力类型，揭示小菜蛾识别性信息素的分子机制，为开发新型性诱剂和小菜蛾的无害化防治提供新思路。【方法】运用Discovery Studio 2.5对小菜蛾性信息素结合蛋白PxylPBP2和受体蛋白PxylOR4进行同源建模，运用程序包中LibDock模块进行分子对接，运用Calculate Energy模块计算复合物结合自由能，分析性信息素Z9-14∶AC与PxylPBP2和PxylOR4的结合模式及相互作用力。【结果】Thr9是PxylPBP2与Z9-14∶AC形成氢键的关键氨基酸残基，Z9-14∶AC易与PxylOR4中的Leu残基产生疏水作用力；PxylPBP2与Z9-14∶AC结合的主要驱动力是静电力，PxylOR4与Z9-14∶AC结合的主要驱动力是范德华力，溶剂化能均抑制Z9-14∶AC与PxylPBP2和Z9-14∶AC与PxylOR4的结合。【结论】小菜蛾性信息素受体蛋白和性信息素结合蛋白在识别和结合性信息素分子方面存在明显差异，性信息素受体蛋白与性信息素反应更灵敏、形成的复合物更稳定。

关键词： 小菜蛾；性信息素；分子对接；结合自由能

中图分类号： S433.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-0928-06

0 引言

【研究意义】小菜蛾[Plutella xylostella （L.）]属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），对十字花科蔬菜危害极大，已取代菜青虫成为十字花科蔬菜上的第一大害虫（陈琼等，2015；尹飞等，2015）。目前对小菜蛾的防治仍以化学防治为主，但大量使用化学杀虫剂造成小菜蛾抗药性迅速提高，致使防治效果逐渐下降（程英等，2014）。性信息素具有无污染、专一性强、对环境安全等优点，使用性信息素防治小菜蛾是无害化防治的重要途径之一。而研究小菜蛾对性信息素识别的分子机制，可为设计新型、高效、廉价的性诱剂替代物提供理论参考。【前人研究进展】在昆虫识别性信息素过程中需要有昆蟲性信息素结合蛋白（Pheromone binding proteins，PBPs）及性信息素受体（Pheromone receptors，ORs）蛋白的参与，首先由水溶性的性信息素结合蛋白与性信息素特异结合形成聚合物启动昆虫的觅食、求偶、交配和产卵等行为（修伟明等，2005），形成聚合物穿过淋巴液后与在神经细胞树突膜上的性信息素受体结合，进而刺激嗅觉神经元产生动作电位，再将携带的化学信息转变为电信号，最终电信号经整合后被传入昆虫大脑并产生相应的行为（郑凯迪和杜永均，2012）。已有研究发现，顺-11-十六碳烯酸酯（Z11-16∶Ac）、顺-11-十六碳烯醛（Z11-16∶Ald）（Tamaki et al.，1977）和顺-9-十四碳烯酸酯（Z9-14∶AC）（Chisholm et al.，1983）是小菜蛾性信息素的主要成分，自昆虫的PBPs和ORs基因被克隆后，与昆虫性信息素有密切关系的PBPs蛋白和ORs蛋白研究也越来越广泛和深入。起初，一些学者用同位素示踪法标记气味分子，研究其与PBPs的作用机理，仅确定了PBPs与气味分子具有结合特性（Vogt et al.， 1988；Ma■b■che-Coisne et al.， 1997），这种实验方法代价较高，放射易衰变，且使用范围有限。随后，Sun等（2012， 2013）克隆出小菜蛾3个基因PxylPBP1、PxylPBP2和PxylPBP3，继而分析其组织表达谱，并用荧光竞争结合实验法证明了小菜蛾性信息素结合蛋白（PxylPBP2）与Z9-14∶AC能特异性结合，气味受体蛋白（PxylOR4）能灵敏地感应Z9-14∶AC，但这种实验方法不能精确知道PxylPBP2、Z9-14∶AC和PxylOR4相互作用的分子机制。由此可知，PxylPBP2、Z9-14∶AC和PxylOR4三者存在一定的对应关系，但目前对昆虫性信息素结合蛋白和受体蛋白的研究主要集中于对气味分子的特异性识别方面（Wanner et al.，2007，2010；Carey et al.，2010）。【本研究切入点】目前缺乏对小菜蛾性信息素结合蛋白、性信息素、受体蛋白三者间相互作用的分子机制研究，对其结合理论的分析是研究三者间作用机制的有效手段。【拟解决的关键问题】对小菜蛾性信息结合蛋白PxylPBP2和受体蛋白PxylOR4同源建模，运用分子对接和计算自由能（MM-PBSA）的方法分析PxylPBP2和PxylOR4与性信息素Z9-14∶AC间的作用力类型、结合的关键位点及自由能，为阐明小菜蛾感受性信息素的分子机制提供参考，也为进一步开发高效、广适的小菜蛾性诱剂并控制小菜蛾种群数量打下理论基础。

1 材料与方法

1. 1 PxylPBP2和PxylOR4三维模型建立及Z9-14∶AC分子结构构建

从NCBI蛋白数据库中下载甜菜夜蛾PxylPBP2和PxylOR4序列，登录号为AGH13203.1和AGK43826.1，三维结构模型运用Discovery Studio 2.5中同源建模模块进行，主要包括从蛋白质晶体数据库（Protein Data Bank，PDB）搜索同源蛋白，将目标蛋白序列与模板蛋白序列对比，建立模型及模型的优化和评估等。

Z9-14∶AC分子结构运用ChemBioOffice 10.0程序包中ChemBioDraw模块构建配基初始结构，再运用ChemBio3D模块构建其空间结构并进行能量最小化优化。

1. 2 分子对接

分别以PxylPBP2和PxylOR4为受体、Z9-14∶AC为配体，运用Discovery Studio 2.5软件对其进行空间结构对接，确定活性区域球的半径，可能的构象Pose（LibDock score>100），采用LibDock模块收集，对接前对受体和配体进行去水、加氢和计算电荷。对接复合物的空间结构进行两次优化，先用最陡下降法优化500步，再用共轭梯度法优化1000步。

1. 3 对接复合物的统计分析

运用Ligplot+软件分析对接复合物的分子间相互作用，统计受体和其相应配体产生疏水作用力的关键氨基酸残基。

1. 4 计算对接复合物自由能

运用分子力学泊松—波尔兹曼表面积法（Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area， MM- PBSA）计算本研究对象中对接复合物的结合自由能（Binding free energy，ΔGbind）（王棐等，2015）。ΔGbind与受体及其相应配体的亲和力呈负相关，MM-PBSA将对接复合物的自由能分解为溶剂化能、真空分子内能及构象变化引起的熵变值，计算公式如下：

ΔGbind=Gcomplex-Greceptor-Gligand

G=Gsolv+EMM-TSMM

Gsolv=GPB+GSUR

EMM=Eelec+EvdW

自由能分为气相和液相两部分，液相自由能即溶剂化能（Solvation energy，Gsolv），包括非极性溶剂化能（Non-polar solvation energy，GSUR）和极性溶剂化能（Polar solvation energy，GPB），由DS 2.5软件的Calculate Energy（计算能量）模块计算，Implicit Solvent Model（隐性溶剂模型）参数设置为Poisson-Boltzmann surface area（PBSA，波尔兹曼表面积），其他参数均为默认值；气相部分的自由能分解为熵变能（Entropy energy，TSMM）和分子力学能（Molecular mechanical energy，EMM），EMM为分子静电相互作用力能（Electrostatic energy，Eelec）和范德华力能（Van der waals energy，EvdW）之和，把Implicit Solvent Model的参数设置为None（无），其他参数均为默认值，TSMM的变化对自由能影响很小，计算中可忽略。

2 結果与分析

2. 1 PxylPBP2和PxylOR4同源建模及Z9-14∶AC的分子结构

经同源性检索，发现两个与PxylPBP2序列有较高相似性的模板（相似性高于30%），登录号为1QWV和1DQE；两个与PxylOR4序列有较高相似性的模板（相似性高于30%），登录号为2IV2和3D7N。以上述模板为基础进行多源建模，构建后结果显示PxylPBP2结构Verify Score为27.30，高于Verify Expected High Score（24.25）；PxylOR4结构Verify Score为41.21，接近Verify Expected High Score（44.14），表明两模型具有较高的可信度，Ramachandran Plot图显示氨基酸均在最适区域，经动力学优化后保存模型。Z9-14∶AC分子结构如图1所示。

2. 2 分子对接和自由能计算

运用Lidock程序，Z9-14∶AC分别与PxylPBP2和PxylOR4对接。在PxylPBP2与Z9-14∶AC对接中，以X=

0.80、Y=-5.86、Z=0.05为活性位点中心，半径为1.42 nm内所有的子结构作为活性口袋部分；在PxylOR4与Z9-14∶AC对接中，以X=80.65、Y=45.65、Z=33.98为活性位点中心，半径为2.28 nm内所有的子结构作为活性口袋。Z9-14∶AC与PxylPBP2对接LibDockscore最高分为132.55，Z9-14∶AC与PxylOR4对接LibDockscore最高分为108.05，结果如图2和图3所示。

由图2-A和图3-A可以看出，Z9-14∶AC与PxylPBP2和PxylOR4均在其袋状腔内结合，图2-B和图3-B为PxylPBP2和PxylOR4与Z9-14∶AC作用的二维图，展示了与Z9-14∶AC发生作用的氨基酸残基。由此可知，PxylPBP2与Z9-14∶AC作用有1个氢键形成（虚线），受体为O3，配体为Thr9∶HG1，键长为0.24 nm，而PxylOR4与Z9-14∶AC作用无氢键形成。

2. 3 Ligplot+分析对接复合物的疏水性氨基酸

将Z9-14∶AC与PxylPBP2和PxylOR4对接复合物导入Ligplot+软件，运算结果如图4所示。由图4可知，PxylPBP2与Z9-14∶AC产生疏水作用氨基酸残基14个，分别为Phe33、Phe12、Phe76、Ile94、Leu61、Leu8、Met114、His69、Val62、Met53、Ala56、Met68、Leu66和Thr111；PxylOR4与Z9-14∶AC产生疏水作用氨基酸残基17个，分别为Leu135、Glu304、Leu320、Phe286、Ser290、Pro303、Arg300、Cys298、Val218、Leu192、Ala159、Gly160、Leu- 306、Val207、Gln158、Cys190和Ile272。分析这些氨基酸残基发现Z9-14∶AC更易与受体中的Leu产生疏水作用力，同时表明疏水作用力能有效促进Z9-14∶AC与PxylPBP2和PxylOR4结合。

2. 4 Z9-14∶AC与PxylPBP2和PxylOR4对接复合物结合自由能计算结果

在对接过程中，配体和受体的结合稳定程度由复合物的自由结合能决定，自由结合能越低，对接后的复合物越稳定（Guang et al.，2012）。运用1.4中的方法计算Z9-14∶AC与PxylPBP2和PxylOR4对接复合物的自由能，结果显示，Z9-14∶AC与PxylPBP2对接复合物自由能为-2.88 kcal/mol，Z9-14∶AC与PxylOR4对接自由能为-48.31 kcal/mol（表1），表明Z9-14∶AC与PxylOR4比与PxylPBP2的结合更加稳定。

通過对两种复合物自由能（表1）各组分拆解分析，发现Z9-14∶AC与PxylPBP2和与PxylOR4结合的驱动力有明显差别，Z9-14∶AC与PxylPBP2结合过程中ΔEelec、ΔEvdW和ΔGSUR均为负值，表明静电作用力、范德华力和非极性溶剂化能对受体和相应配体的结合具有促进作用，但静电力是主要驱动力，极性溶剂化能对配体和受体的结合具有较强的抑制作用；Z9-14∶AC与PxylOR4的结合过程中ΔEvdW和ΔGSUR为负值，ΔEelec和ΔGPB为正值，表明范德华力和非极性溶剂化能为两者结合的正驱动力，其中范德华力为主要作用力，静电力和极性溶剂化能具有抑制两者结合的功能，其中极性溶剂化能起主要作用。

3 讨论

在昆虫的信息感受机制中，首先通过气味结合蛋白（包括性信息素结合蛋白）与气味分子相互作用从而与外界进行信息交流（Schulz，2005），疏水性的气味分子与亲水性的气味结合蛋白结合后，穿过昆虫感受器淋巴液，并将其运送至感觉神经元膜上的气味受体（Nakagawa et al.，2005）。在这个过程中，气味结合蛋白很可能对气味分子进行初步筛选后再进行运输，而特异性识别气味分子主要由气味受体蛋白完成（Vosshall et al.，1999；Zwiebel and Takken，2004）。目前，对昆虫感受气味分子、刺激气味受体主要存在两种预测方式：一是气味结合蛋白和气味分子形成复合体刺激，二是气味结合蛋白将气味分子释放后再由气味分子单独刺激，但这些理论均建立在间接证据之上，没有确凿的实验数据结果支撑。本研究发现，小菜蛾性信息素Z9-14∶AC与性信息素结合蛋白PxylPBP2结合的自由能（-2.88 kcal/mol）远高于Z9-14∶AC与受体蛋白PxylOR4结合的自由能（-48.31 kcal/mol），说明前者的结合能力远低于后者，即性信息素结合蛋白对性信息素结合能力远低于受体蛋白对性信息素的结合能力。这为证明识别气味分子主要是由气味受体蛋白完成的推测提供了直接证据。

信息素分子与信息素结合蛋白结合位点上的氨基酸发生相互作用，氨基酸亲水性和带电性间的相互作用可能是导致配基特异结合的原因（Sandler et al.，2000）。本研究分析了PxylPBP2和PxylOR4中与Z9-14∶AC产生疏水作用的氨基酸残基和氢键，PxylPBP2与Z9-14∶AC作用产生1个氢键，PxylOR4与Z9-14∶AC无氢键产生。氢键具有稳定性、方向性和饱和性，可以增强化合物稳定性（王海燕等，2005），但结果显示含有氢键复合物的结合能力远低于不含有氢键的复合物，说明氢键的作用具有局限性，配体与受体的结合可能是受结合腔内多种作用力共同作用的结果（李红亮等，2013）。从结合自由能的各组分拆解分析可知，PxylPBP2和PxylOR4与Z9-14∶AC的机制存在差异，首先两者的主要驱动力不同，静电力为PxylPBP2与Z9-14∶AC结合的主要驱动力，但对PxylOR4与Z9-14∶AC的结合有一定的抑制作用；范德华力是PxylOR4与Z9-14∶AC结合的主要驱动力，且对PxylPBP2和Z9-14∶AC的结合也有一定的促进作用，与众多文献的报道一致（Novotny et al.，1997；Chong et al.，1999），分析还发现溶剂化能对两者均有较强的抑制作用，这些因素可能是形成两种蛋白均能结合性信息素的依据，但结合能力存在差异。其他更精细的研究如蛋白中单个氨基酸残基在结合过程中的作用还需通过分子动力学分析来完成。

4 结论

本研究结果表明，小菜蛾性信息素受体蛋白和性信息素结合蛋白对性信息素的识别和结合力存在明显差异，性信息素受体蛋白对性信息素反应更灵敏、形成的复合物更稳定。性信息素结合蛋白与性信息素结合的关键氨基酸是Thr9，主要驱动力是静电力能；性信息素受体蛋白与性信息素结合的主要驱动力是范德华力。

参考文献：

陈琼，陈洁琼，黄水金，陈洪凡，秦文婧，秦厚国. 2015. 小菜蛾对唑虫酰胺的抗性现实遗传力及风险评价[J]. 江苏农业学报，31（2）： 267-271.

Chen Q， Chen J Q， Huang S J， Chen H F， Qin W J， Qin H G. 2015. Realized heritability and risk assessment of resistance of Plutella xylostella to tolfenpyrad[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，31（2）： 267-271.

程英，李文红，金剑雪，李凤良. 2014. 小菜蛾不同抗性品系对杀虫剂的抗药性测定[J]. 西南农业学报，27（3）：1104-1108.

Cheng Y，Li W H，Jin J X，Li F L. 2014. Determination of pesticide resistance of different Plutella xylostella resistant strains[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，27（3）：1104-1108.

李红亮，张林雅，庄树林，倪翠侠，韩宝瑜，商晗武. 2013. 中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析[J]. 中国农业科学，46（1）：154-161.

Li H L， Zhang L Y， Zhuang S L， Ni C X， Han B Y， Shang H W. 2013. Interpretation of odorant binding function and mode of general odorant binding protein ASP2 in Chinese honeybee（Apis cerana cerana）[J]. Scientia Agricultura Sinica， 46（1）：154-161.

王棐，張海玲，光翠娥，桑尚源，杨红飞. 2015. 大豆皂苷I抑制唾液酸转移酶的分子机理研究[J]. 食品与生物技术学报， 34（4）： 355-360.

Wang F， Zhang H L， Guang C E， Sang S Y，Yang H F. 2015. Mechanism of interaction between sialyltransferase and its inhibitory soyasaponin I[J]. Journal of Food Science and Biotechnology， 34（4）： 355-360.

王海燕，曾艳丽，孟令鹏，郑世钧. 2005. 有关氢键理论研究的现状及前景[J]. 河北师范大学学报（自然科学版）， 29（2）： 177-181.

Wang H Y， Zeng Y L， Meng L P， Zheng S J. 2005. Current situation and prospect of researches on hydrogen bond theory[J]. Journal of Hebei Normal University（Natural Science Edition）， 29（2）： 177-181.

修伟明， 董双林， 王荫长. 2005. 昆虫信息素结合蛋自及其分子运输机制和生理功能研究进展[J]. 昆虫学报， 48（5）： 778-784.

Xiu W M， Dong S L， Wang Y C. 2005. Pheromone binding proteins in insects with emphasis on their molecular transport and physiological functions[J]. Acta Entomologica Sinica， 48（5）： 778-784.

尹飞，冯夏，李振宇，胡珍娣，林庆胜，陈焕瑜. 2015. 不同地区小菜蛾对氯虫苯甲酞胺的抗药性差异[J]. 植物保护， 41（5）： 160-163.

Yin F， Feng X， Li Z Y， Hu Z D， Lin Q S， Chen H Y. 2015. Resistance of diamondback moth to chlorantraniliprole in different areas[J]. Plant Protection， 41（5）： 160-163.

郑凯迪， 杜永均. 2012. 蛾类昆虫性信息素受体及其作用机理[J]. 昆虫学报， 55（9）： 1093-1102.

Zheng K D， Du Y J. 2012. Pheromone receptors and their function in moths[J]. Acta Entomologica Sinica，55（9）： 1093-1102.

Carey A F， Wang G， Su C Y， Zwiebel L J， Carlson J R. 2010. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae[J]. Nature， 464（7285）： 66-71.

Chisholm M D， Steck W F， Underhill E W， Palaniswamy P. 1983. Field trapping of diamondback moth Plutella xylostella using an improved four-component sex attractant blend[J]. Journal of Chemical Ecology， 9（1）： 113-118.

Chong L T， Duan Y， Wang L， Massova I， Koflman P A. 1999. Molecular dynamics and free-energycalculations applied to affinity maturation in antibody 48G7[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 96（25）： 14330-14335.

Guang C， Shang J G， Jiang B. 2012. Transport of traditional Chinese pimple milk-derivedangiotensin-converting enzyme（ACE） inhibitory peptides across a Caco-2 cell monolayer and their molecular recognition with ACE[J]. Journal of Food， Agriculture & Environment， 10（3-4）：40-44.

Ma■b■che-Coisne M， Sobrio F， Delaunay T， Lettere M， Dubroca J， Jacquin-Joly E， Meillour P N L. 1997. Pheromone binding proteins of the moth Mamestra brassicae： specificity of ligand binding[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 27（3）：213-221.

Nakagawa T， Sakurai T， Nishioka T， Touhara K. 2005. Insect sex-pheromones signals mediated by specific combinations of olfactory receptors[J]. Science， 307（5715）：1638-1642.

Novotny J， Bruccoleri R E L， Davis M， Sharp K A. 1997. Empirical free energy calculations： a blind test and further improvements to the method 1[J]. Journal of Molecular Biology， 268（2）：401-411.

Sandler B H， Nikonova L， Leal W S， Clardy J. 2000. Sexual attraction in the silkworm moth： structure of the pheromone-binding-protein-bombyko complex[J]. Chemistry & Biology， 7（2）： 143-151.

Schulz S. 2005. The Chemistry of Pheromones and Other Semiochemicals II[M]//Leal W S. Pheromone Reception. New York： Springer： 341-360.

Sun M J， Liu Y， Wang G R. 2012. Expression patterns and binding properties of three pheromone binding proteins in the diamondback moth， Plutella xyllotella[J]. Journal of Insect Physiology， 59（1）： 46-55.

Sun M J， Liu Y， Walker W B， Liu C C， Lin K， Gu S H， Zhang Y J， Zhou J J， Wang G R. 2013. Identification and characterization of pheromone receptors and interplay between receptors and pheromone binding proteins in the diamondback moth， Plutella xyllostella[J]. PLoS One， 8（4）： e62098-e62112.

Tamaki Y， Kawasaki K， Yamada H， Koshihara T， Osaki N， Ando T， Yashida S， Kakinohama H. 1977. （Z）-11-hexa-

decenal and （Z）-11-hexadecenyl acetate： sex-pheromone components of the diamonback moth （Lepideptera： Plutellidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 12（2）： 208-210.

Vogt R G，Prestwich G，Riddiford L. 1988. Sex pheromone receptor proteins. Visualization using a radiolabeled photoaffinity analog[J]. Journal of Biological Chemistry， 263（8）：3952-3959.

Vosshall L B， Amrein H， Morozov P S， Rzhetsky A， Axel R. 1999. A spatial map of olfactory receptor expressionin the Drosophila antenna[J]. Cell， 96（5）：725-736.

Wanner K W， Nichols A S， Allen J E， Bunger P L， Garczynski S F， Linn C E. 2010. Sex pheromone receptor specificity in the European corn borer moth， Ostrinia nubilalis[J]. PLoS One， 5（1）：285-300.

Wanner K W， Nichols A S， Walden K K O， Brockmann A， Luetje C W， Robertson H M. 2007. A honey bee odorant receptor for the queen substance 9-oxo-2-decenoic acid[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 104（36）： 14383-14388.

Zwiebel L J， Takken W. 2004. Olfactory regulation of mosquito-host interactions[J]. Insect Biochemistry and Molecular Bio-

logy， 34（7）： 645-652.

（責任编辑 麻小燕）