不同内生真菌对千年桐幼苗生长及主要矿质元素的影响

林晗 洪陈洁 洪滔 谢安强 范海兰 陈欣凡

摘 要 为探讨内生真菌对植株生长及养分含量的影响，选取8种千年桐内生真菌菌株对千年桐幼苗接种，60 d后测定植株生长指标以及叶片和根系部分主要矿质元素含量。结果表明，拟盘多毛孢属和盾壳霉属菌株对地径和苗高增长的影响最为明显。接种1 ∶ 2比例混合的木霉属与毛霉菌属菌株后，苗木生物量和根冠比的增幅显著。盾壳霉属、链格孢属以及木霉属菌株处理后叶片氮含量较对照增加了50%以上，根系氮含量增加了85%以上。链格孢属以及木霉属菌株有效地推动了千年桐幼苗磷含量的增长，较对照增幅超过2倍以上。盾壳霉属和木霉属菌株较大程度提高了幼苗的钾含量。对比不同菌株处理对促进千年桐幼苗的叶片和根系养分元素含量的效果可发现，接种盾壳霉属、链格孢属和木霉属菌株后，植株根系氮和磷含量的增加程度显著高于地上部分；而镰刀菌属和生赤壳属菌株对促进植株根系钾含量的效果更为明显。相较于单种菌株，木霉属和毛霉菌属菌株混合接种就促进植株养分吸收的效果而言并未表现出明显优势。

关键词 内生真菌；千年桐；主要矿质元素；混合菌株

中图分类号 S718.52 文献标识码 A

The Effect of Various Endophytic Fungi on the Growth and

Main Element Contents of Aleurites montana Seedlings

LIN Han1，2， HONG Chenjie1，2， HONG Tao1，2， XIE Anqiang1，2，

FAN Hailan1，2， CHEN Xinfan1，2， WU Chengzhen1，2，3 *

1 Forestry College of Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Key Laboratory of Fujian Universities for Forest Ecological System Process and Management， Fuzhou， Fujian 350002， China

3 Ecology and Environment College of Wuyi University， Wuyishan， Fujian 354300， China

Abstract To explore the effect of endophytic fungi on plant growth and nutrient contents， we chose 8 kinds of endophytic fungi to inoculate on Aleurites montana seedlings and determined the plant growth parameters and main element contents of leaves and roots after 60 days. The results showed that root collar diameter and height improved significantly when applied by Pestalotiopsis and Coniothyrium while biomass and root shoot ratio increased largely by the combined fungi of Trichoderma and Mucor in proportion of 1 ∶ 2. Compared with those of uninoculated seedlings， the N contents increased over 50% in leaves and over 85% in roots by the treatments of Coniothyrium， Alternaria and Trichoderma， the P contents doubled by Alternaria and Trichoderma and the K contents improved to a large extent by Coniothyrium and Trichoderma. By comparing the effects of various endophytic fungi on the nutrient contents in leaves and in roots， we found that the N and P contents in the roots increased faster than those in the leaves when treated by Coniothyrium， Alternaria and Trichoderma. Fusarium and Bionectria had obvious effects on the K contents in the roots. Compared with single endophytic fungi， the combination of Trichoderma and Mucor didn't present obvious advantages on improving plant nutrient contents.

Key words Endophytic fungi； Aleurites montana； Main element contents； Combined fungi

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.023

植物内生真菌普遍存在于健康植物的各组织、器官中，并且其宿主植物一般不表现出明显的被感染病症[1-2]。前人对内生真菌感染禾草类植物的研究结果表明[3]，内生真菌能增强宿主的竞争能力，促进宿主植株生长，提高其对生物胁迫和非生物胁迫的抗性。近年来，对木本植物-内生真菌共生体的研究也引起越来越多关注，已有研究表明[4-6]，内生真菌会随着柏木（Cupressus funebris）幼苗的生长发育而生长，并对植物产生包括各种养分元素和生理状况的影响；接种内生真菌的桉树（Eucalyptus spp.），其抗寒性有所增强；与马尾松（Pinus massoniana）共生的内生真菌能够形成和宿主植物相同的次生代谢产物。

千年桐（Aleurites montana）属大戟科（Euphor-biaceae）落叶阔叶乔木，其种子的含油率很高，可被广泛应用在各个领域，也是代替柴油的理想品种[7-8]。作为中国优良的油料作物树种，因其适宜温暖和湿润的气候而在南方特别是福建省被大量推广种植。并且，千年桐的凋落物归还量较大，有利于维护林地的长期生产力，在闽北林区近年来开始尝试将千年桐作为生物质能源树种、经济林树种和生态林树种开展多功能复合式经营。由于用千年桐直接下种更新的方式营造和修复低效的生态林效果良好，千年桐往往栽植于土壤瘠薄的陡坡，不便对其进行人工抚育与施肥。因而提高千年桐的养分利用效率，维持树体营养平衡对于其生长和果实收获尤为重要。内生真菌接种有助于将土壤中的有机养分转化为利于植物直接吸收利用的无机可溶性离子[9]，对促进植株生长，提高土壤养分的利用率，特别对N和P的吸收促进作用较为显著。

前期研究发现，在自然条件下，千年桐植株具有丰富的内生真菌，但这些真菌对宿主植物的作用如何尚不清楚。本研究应用福建农林大学森林生态系统过程与经营重点实验室筛选的8种千年桐内生真菌菌株对千年桐幼苗接种，形成内生真菌-千年桐共生体，在幼苗的生长过程中测定植株生长指标以及叶片和根系部分矿质元素含量，分析内生真菌对千年桐幼苗生长和养分元素的影响，并比较单一菌株与不同比例混合菌株接种的差异，拟为筛选促进千年桐养分利用的内生真菌菌株提供理论基础和优良菌种信息，以此优化千年桐的培育技术，提高其经济、生态和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地概况 试验地位于福建农林大学福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室田间，试验地（25°15′～26°39′N，118°08′～120°31′E）属于典型的亚热带季风气候，温暖湿润，雨量充沛，少霜无雪，夏长冬短，无霜期达326 d。年平均日照数为1 700～1 980 h；年均降水量为900～2 100 mm；年均温为20～25 ℃，最冷月为1～2月，其平均气温达6～10 ℃；最热月为7～8月，平均气温为33.7 ℃。极端高温为42.3 ℃，极端低温为-2.5 ℃，年相对湿度约77%。

1.1.2 菌种选择与菌液制备 菌种来自福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室千年桐材料分离试验获得的8个强势菌株（菌株已保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心），并将其中2种菌株进行2种不同比例混合，形成10种菌液，每种菌液3次重复（表1）。

菌液制备：将供试菌株接入50 mL的液体培养基，在恒温振荡培养箱中经过72 h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度，配制成5.5×106 cfu/mL菌液[5]。

1.2 方法

1.2.1 千年桐-内生真菌共生体的构建 本试验采用土培盆栽试验，试验所用千年桐幼苗为福建省建阳市林业局提供的千年桐1年生实生苗。选择长势一致的苗木于2014年5月定植于直径15 cm，高10 cm的塑料盆中，每盆放入3 kg严格经过熏蒸消毒的黄心土。经过2个月的恢复性生长后开始对其进行接种，接种前其初始苗高、地径分别为（32.72±3.02）cm和（5.28±0.77）cm。经显著性检验，各处理间苗高、地径之间差异不显著（p>0.05）。

于2014年7月4日开始连续3 d于千年桐苗木根际施入相同浓度的100 mL菌液。含对照共11个处理（表1），每个处理重复3次，每个重复接种10株苗木。接种60 d后测定苗木的苗高和地径。

1.2.2 植株养分元素的测定 参考中华人民共和国林业行业标准《森林土壤分析方法》[10]，用重铬酸钾氧化-外加热法测定植株全碳（即有机质）含量；采用凯氏定氮法测定植株全氮含量；采用HNO3-HClO4消煮，钼锑抗比色法测定植株磷含量；采用原子吸收分光光度法测定植株全钾含量。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据和图表的处理，用SPSS软件对数据进行多重比较和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同内生真菌对千年桐幼苗生长的影响

接菌60 d后，千年桐幼苗的地径和苗高之间差异均达到显著水平（p<0.05）。比较各个处理的地径增长率可知（图1），接种菌株ZY6后苗木地径增长率最大，而菌株ZY4对促进地径增长的作用最小。其中，浇施7种菌株后的千年桐幼苗地径增长率均高于未接菌的千年桐幼苗（CK），尤其是施加ZY6、ZY5、以及ZJ2后，地径较未接种千年桐相比增长了2倍以上。

浇施10种菌液后，千年桐幼苗的平均苗高增长率在14.07%～44.38%（图1），均显著高于未接菌千年桐幼苗的增长率（7.72%），其中ZJ2、ZY5、ZY3对苗高增长的影响最为明显。

就生物量的变化而言，除了接种木霉属菌株ZY3，链格孢属菌株ZY4以及盾壳霉属菌株ZY5后千年桐苗木生物量低于对照，其余处理后的苗木生物量均显著高于未接菌苗木，尤其是浇施混合酶H3和拟盘多毛孢属菌株ZJ2后，苗木生物量约为CK的2倍以上，显著高于其他处理（图2）。

浇施混合酶H3后，千年桐苗木的根冠比高于其他处理，拟盘多毛孢属菌株ZJ2处理的苗木根冠比低于其他处理（图3）。

2.2 不同内生真菌对千年桐幼苗C和N含量的影响

由图4-A可知，ZJ2和ZY3接种后千年桐叶片具有最高的碳含量，而ZY4的碳含量显著小于其他处理。尽管接种5种菌株后叶片碳含量高于未接菌苗木（CK），但基本并未出现显著差异（p>0.05）；而所有接种了菌株的幼苗根系碳含量都显著小于对照组（p<0.05）。由此可见，接菌并未对千年桐幼苗的碳含量产生明显促进作用。与碳含量相比，接种内生真菌对千年桐地上地下部分的氮含量产生明显影响，除了H3处理，接菌后千年桐幼苗的氮含量显著高于对照，尤其是ZY3、ZY4和ZY5菌株处理后叶片N含量较对照增加了50%以上，根系N含量增加了85%以上（图4-B）。各个菌株处理后千年桐苗木C/N差异不大，但基本低于对照，根系C/N与对照的差异尤为明显，极显著低于对照（p<0.01）（图4-C）。

2.3 不同内生真菌对千年桐幼苗P含量的影响

由图5可知，ZY4处理的幼苗叶片P含量显著高于其他菌株处理（p<0.05），ZY4、ZY3和ZY5处理的幼苗根系P含量显著高于其他菌株处理（p<0.05）。除了ZY6叶片P含量与CK相当，所有菌株处理的地上地下P含量均高于CK，尤其是ZY4，ZY1和ZY3处理的叶片P含量是CK的2倍以上，ZY4，ZY3和ZY5处理的根系P含量是CK的3倍以上。除了ZJ2和H3，不同菌株处理的千年桐幼苗地下部分磷含量均显著高于地上部分。由此可知，与千年桐幼苗共生的内生真菌对植株P含量的变化具有明显影响，对地下部分P含量增长的促进作用尤为明显。

2.4 不同内生真菌对千年桐幼苗K含量的影响

从图6可以看出，除了菌株ZJ2处理以外，不同菌株处理的千年桐幼苗根系钾含量均高于叶片。ZJ2，ZY5和ZY3菌株处理的叶片K含量最高，分别高于对照处理的32.18%， 25.71%和13.44%，ZY6，ZG2和ZY5菌株处理的根系K含量高于其他处理，均高于处理均值的10%以上。

3 讨论与结论

3.1 内生真菌对植株生长的影响

本试验结果表明，与未接菌的植株相比，接种不同内生真菌总体而言对于千年桐幼苗的生长和主要矿质元素吸收具有不同程度的促进作用。对不同种植物内生真菌的研究也得出了同样的结论[11-12]。其主要原因可能有以下几个方面：第一，内生真菌可影响寄主植物地上部分和根系的酶表达，例如提高植株谷氨酰胺合成酶的活性，增加硝酸还原酶的数量，从而影响植物的氮代谢水平[12-13]。一些内生菌与植株共生后能分泌多种胞外酶[14-15]，这些酶为提高宿主植物对养分的潜在利用能力创造条件，进而促进了植物的生长。第二，内生真菌能够影响植物内源激素含量和他们之间的平衡。内生真菌能够产生许多促进植物生长的激素，一些如生长素、细胞分裂素等植物激素有助于促进根系生长，扩大根系吸收面积，增加根量和根系活力，从而提高植物对N、P和K等矿质元素的吸收，也增加了养分的积累和迁移[16-18]。第三，共生的内生真菌可以通过多样化途径以增强植株的营养生理。有的内生真菌能够在体外培养条件下利用铵盐或硝酸盐作为氮源[12]。一些内生真菌侵入植物根皮细胞后形成菌丝结构，皮层细胞中的真菌菌丝可被植物消解，成为养分摄入的一种途径[11]。对兰科植物的研究也证实，其根部共生的真菌通过激活植株的离子转运系统[19]，可以增强兰科植物对养分的吸收利用效率。

3.2 内生真菌对植株地上地下部分养分分配的影响

在叶际和根际区域，植物体时刻与众多的有害、有益和中性微生物共同生存，并产生直接或间接的接触[12]。本研究对比不同菌株处理对促进千年桐幼苗的地上地下部分养分元素含量的效果可发现：接种内生真菌对植株根系N和P含量的增加幅度显著高于地上部分，接种盾壳霉属菌株、链格孢属菌株和木霉属菌株表现得尤为明显。镰刀菌属菌株和生赤壳属菌株促进地下部分K含量的效果显著优于地上部分，拟盘多毛孢属菌株则相反。Redman等[20]对水稻的研究也发现，共生的内生真菌影响了水稻体内营养在地上地下部分的分配，植株优先将养分分配给根部，以促进根部发育，进而提高植株对养分摄取的能力。但对兰科植物的研究又发现[21]，接种3种内生真菌对于大花蕙兰地上部分N、P和K含量的增幅明显高于地下部分。与内生真菌共生的植株对养分在地上地下的分配究竟与植株本身有关，或者受定殖在根系的真菌菌丝吸收同化能力影响目前仍不可知，有待进一步分析研究。

3.3 单一菌株与混合菌株作用的比较

前人研究发现，很多生物化学过程的实现有赖于多种微生物的共同培养，依靠单种微生物的微弱作用难以完成整个过程[22]。同时，由于单种微生物作用的不稳定性，2种或以上微生物的共同作用越来越引起学者们的关注。有报道指出，相较于单一菌株，多种内生真菌的混合接种具有更好的促生作用，制造更多的代谢产物，产生更强的抑菌效果，甚至合成新化合物[22-24]。本试验中将木霉属与毛霉菌属菌株按照不同比例混合接种，与对照相比，促进了苗木生物量和根冠比的增加，显著提高了植株根系的N含量以及叶片和根系的P含量。但是相较于木霉属和毛霉菌属单种菌株的接种效果，混合接种并未表现明显优势。不同内生真菌之间往往产生直接或间接的相互作用，既可能提供彼此所需的养分，转移或消除抑制产物，刺激相互的生理活性[25]，也可能存在竞争，或者某一菌株具有排他性。前人研究也发现，不同菌种及组合对不同杜鹃属植物的促生效果不同，混合菌剂对马缨杜鹃的效果较好，而露珠杜鹃更适于单株菌株接种[26]。本试验中2种菌株混合对千年桐养分含量的促进作用弱于单一接种，这可能是由于木霉属和毛霉菌菌株在定殖或生长过程中发生相互竞争作用，2种菌株之间的拮抗抑制了其作用的发挥。由此考虑，如果将木霉属和毛霉菌菌株混合接种，其促进千年桐养分吸收的效果可能不及单一菌株处理。

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