小麦属物种ω-醇溶蛋白序列的克隆与分析

李增林，吴丹丹，李洪雨，陈 刚，刘小娟，甯顺腙，刘登才，张连全

(四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130)



小麦属物种ω-醇溶蛋白序列的克隆与分析

李增林，吴丹丹，李洪雨，陈 刚，刘小娟，甯顺腙，刘登才，张连全

(四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130)

摘要：为了挖掘ω-醇溶蛋白在小麦品质育种中的潜力，利用2对引物采用基因组PCR方法分别从阿拉拉特小麦(Triticum timopheevi Zhuk. var. araraticum)、栽培二粒小麦 (Triticum turgidum ssp. dicoccon)、提莫菲维小麦(Triticum timopheevi)、 栽培一粒小麦(Triticum monococcum ssp. monococcum)和野生一粒小麦(Triticum monococcum var. boeoticum)5个小麦属物种中克隆出ω-醇溶蛋白序列，并对其进行序列分析。结果表明，本研究共克隆到6条新的ω-醇溶蛋白序列，归属于ARH、ATN和TRQ三种类型。这些新的ω-醇溶蛋白序列的长度为927～1 095 bp。在这6个序列中，除KR082150拥有两个甲硫氨酸(Met)外，其余的均缺少含硫氨基酸。进化分析表明，本研究获得的6条ω-醇溶蛋白序列聚在了2个主要的分支，其中N端第一个氨基酸为丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一个大的分支中，而TRQ类型的则聚在了另一个分支中。

关键词：小麦属物种；ω-醇溶蛋白；基因克隆；系统进化

小麦胚乳贮藏蛋白主要由麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成，其中，麦醇溶蛋白约占小麦胚乳贮藏蛋白总量的50%～60%[1-3]，主要决定面团的粘性和延展性[4-6]。根据醇溶蛋白在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率和分子结构的不同，可分为α-/β-、γ-和ω-三大类[5,7-8]。根据成熟蛋白N端的前三个氨基酸可将ω-醇溶蛋白分为ARQ/E、KEL、SRL和TRQ等类型[9-11]。但ω-醇溶蛋白的基本结构比较保守，包括含19个氨基酸残基的信号肽区域、含12个氨基酸残基的N-末端、含90%～96%的氨基酸的中央重复区、含9～12个氨基酸残基的C-末端4个区域[9,11]。ω-醇溶蛋白的主要特征是含有大量的谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)残基(总共占到氨基酸残基数的80%)，但是明显缺乏含硫氨基酸，即半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)[12-13]。研究表明，醇溶蛋白不仅与小麦的加工品质密切相关，也是遗传性疾病-乳糜泻(Celiac diease,CD)的主要外在刺激蛋白[14-18]。其中，在ω-醇溶蛋白中发现3种(Gli-ωt: PQQPFPQQ; Gli-1: PFPQPQQPF; Gli-2: PQPQQPFPW)可诱发CD发生的T-细胞免疫肽段[16-18]。尽管了解和运用ω-醇溶蛋白具有非常重要的意义，但目前通过PCR克隆得到的ω-醇溶蛋白数量仍然非常有限[9-10,19-22]。鉴于此，本研究拟以小麦属物种阿拉拉特小麦(TriticumtimopheeviZhuk. var.araraticum,AAGG,2n=4x=28)、栽培二粒小麦(Triticumturgidumssp.dicoccon,AABB,2n=4x=28)、提莫菲维小麦(Triticumtimopheevi,AAGG,2n=4x=28)、栽培一粒小麦(Triticummonococcumssp.monococcum,AA,2n=2x=14)和野生一粒小麦(Triticummonococcumvar.boeoticum,AA,2n=2x=14)为材料，采用基因组PCR法进行ω-醇溶蛋白序列克隆，并对其进行序列分析，以期丰富ω-醇溶蛋白的遗传信息，为ω-醇溶蛋白的结构与功能研究提供参考。

1材料与方法

1.1 供试材料

供试材料共计5份，包括阿拉拉特小麦(PI352265)、栽培二粒小麦(PI352365)、提莫菲维小麦(PI221421)、栽培一粒小麦(PI352479)和野生一粒小麦(G52)，除G52由四川农业大学小麦研究所提供外，其他均由美国种质资源信息库(NPGS)惠赠。

1.2 ω-醇溶蛋白序列的克隆

用DNA提取试剂盒 Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN公司)提取室内培养一周左右的植株叶片DNA。引物F1/R1(F1:5′-TCAAGG TGTGTAGTGTAAAG-3′; R1:5′-ATTTGTCC TGGTTGCTAGGAA-3′)和F2/R2(F2:5′-GC TAGGG/CAA/GT/CTAAACCCTAA/GC-3′; R2: 5′ - TCATTGGCCACCGATGCT/CTG/ATT-3′)分别依据李 敏等[23]和庄倩倩等[22]文献报道的序列所设计。PCR扩增体系：模板DNA 100 ng，10×LA PCR buffer 5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 5 μL,上下游引物各(20 μmol·L-1)1.5 μL，2.5 U的高保真LATaq酶(TaKaRa公司)0.5 μL，加ddH2O补足50 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后选择合适的片段进行回收，并与pMD19-T载体 (TaKaRa公司)连接。将连接产物转入大肠杆菌DH10感受态细胞中，然后通过菌液PCR鉴定阳性克隆。最后随机挑取5个阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3序列分析

用DNAMAN软件(Version 6.0.3,Lynnon Biosoft,Canada)将核苷酸序列翻译为氨基酸序列。用Clustal X 2.0软件对核苷酸及氨基酸序列进行比对。用NCBI提供的在线BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 工具对核苷酸及氨基酸序列的同源序列进行搜索。用Mega 6.0软件(邻接法)构建系统进化树。

2结果与分析

2.1小麦属物种中ω-醇溶蛋白序列的克隆

利用引物F1/R1和F2/R2对5个小麦属物种的总DNA进行PCR扩增，得到6条大小约1 000 bp的目的条带(图1)。将目的条带回收纯化后连接到pMD19-T载体，通过菌液PCR鉴定出阳性克隆后进行了测序。测序获得6个不同的序列(F1/R1的PCR产物5个，F2/R2的PCR产物1个)。NCBI在线BLAST表明，6个新序列与已知的ω-醇溶蛋白基因序列相似度大于86%。将这6个新序列提交至Genbank，得到序列登录号为KR082149～KR082154。通过ORF Finder分析发现，这6个新序列均不含有内含子，但是都存在至少4个终止密码子，推测这些序列全部为假基因。

M：DL1000；1～5：引物组合F1/R1的PCR产物，依次来源于PI352265、PI352365、PI221421、G52和PI352479；6：引物组合F2/R2的PCR产物，来源于PI352265

M: DL1000; 1-5: PCR products amplified with the primer pair F1/R1,which are respectively from PI352265,PI352365,PI221421,G52 and PI352479; 6: PCR product amplified with the primer pair F2/R2,which is from PI352265

图1PCR扩增产物的电泳分析

Fig.1PCR amplification products

separated by 1.5% agarose gel

2.2氨基酸序列分析

将本研究推导得到的6个氨基酸序列进行了比对分析，发现其与已发表的ω-醇溶蛋白拥有相同的保守结构，即含有由19个氨基酸组成的信号肽、由12个氨基酸组成的N端区、由90%～96%的氨基酸组成的中央重复区和由9～11个氨基酸组成的C端区(图2)。 氨基酸序列的前三个氨基酸决定ω-醇溶蛋白的类型[9-10]，本研究推导得到的6个ω-醇溶蛋白序列包含ARH、ATN和TRQ三种类型(图2)。与之前的报道[12-13]一致，本研究获得的序列在中央重复区富含谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)，但是明显缺乏含硫氨基酸，即缺乏半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)，本研究所得6个新序列中仅KR082150含有两个甲硫氨酸。

尽管ω-醇溶蛋白序列比较保守，我们对克隆获得的6条和已发表的3条ω-醇溶蛋白序列相互比对，结果发现，ω-醇溶蛋白序列的N端和C端之间均有部分差异。首先N端的前三个氨基酸变异较普遍，其大多是由碱基突变造成的，如编码第一个氨基酸处的核苷酸G突变成A就会导致氨基酸丙氨酸(Ala)被苏氨酸(Thr)取代(图2)。而N端后半部分的序列相对比较保守，只有KR082150和JN092580两条序列与其他相比差异较大，而这两条序列恰好都是TRQ类型的ω-醇溶蛋白(图2)。相比N端，ω-醇溶蛋白C端差异更大，不同的序列有自己专属的C端，本研究所克隆的KR082150的C端类型在之前尚未见报道。此外，ω-醇溶蛋白C端的氨基酸数目也不尽相同，图2展示了四种，C端的氨基酸数目分别为9、10、11和12，而我们克隆获得的ω-醇溶蛋白序列有三种，C端的氨基酸数目分别为9、10和11。

2.3系统进化分析

为了研究ω-醇溶蛋白序列的进化关系，将本研究获得的序列与NCBI数据库目前已知的其中6个典型的ω-醇溶蛋白序列构建了系统进化树，结果(图3)发现，这些ω-醇溶蛋白序列分成了2个主要的分支。N端第一个氨基酸为丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一个大的分支中，包括ARH、ATN、ARE和ARQ四种类型，其中ATN类型的位于ARH类型之间，并且ARE类型的AF280605较ARQ类型的FJ561452距ARH类型更远。另一个分支包括TRQ和SRL两种类型，其中TRQ类型的KR082150和JN092581聚在了一个亚分支下，较SRL类的AB181301更近。由此可知，ω-醇溶蛋白的类型可能与进化相关，ω-醇溶蛋白以丙氨酸(Ala)开头的可能来源相同，TRQ类型的较其他更为保守。

实线框表示序列存在较大差异；“---”表示本文不做分析的中央重复区序列；“·”表示此处没有碱基

The variation in sequence marked with solid box；“---” represented the repetive domain sequence and not analyzed in this study;“·” represented no base here

图2ω-醇溶蛋白的多序列比对

Fig.2Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of ω-gliadins

图3　ω-醇溶蛋白的进化分析

3讨 论

醇溶蛋白作为小麦籽粒贮藏蛋白中最丰富的组分之一，与麦谷蛋白一起对小麦的加工品质有重要影响[13]。目前，除了Hsia和Anderson[16]采用筛选λ基因组文库法得到了少量ω-醇溶蛋白序列外，利用PCR技术获得的ω-醇溶蛋白序列非常少[9-10,19-24]。因此对于新的更多的ω-醇溶蛋白序列的鉴定显得尤为重要。在本研究中，我们从5个小麦属物种中克隆出了ARH、ATN 和TRQ三种类型的6条新的ω-醇溶蛋白序列。由于其编码区内均没有发现内含子，并且都存在至少4个终止密码子，所以这6条ω-醇溶蛋白序列被推断为假基因。分析其终止密码子的数目可以发现，二倍体的栽培一粒小麦和野生一粒小麦ω-醇溶蛋白氨基酸序列中的终止密码子数目(8～9个)要显著多于四倍体小麦(4～6个)。由于没有前人确定性的结论，结合分析结果，我们推测，终止密码子的出现可能会因染色体的组成而异,其具体规律有待进一步的研究。

众所周知，ω-醇溶蛋白明显缺乏含硫氨基酸[12-13]，正是基于这种原因，ω-醇溶蛋白无法利用分子间二硫键参与形成更大的分子，所以对面包的品质贡献很小[5,13,22]。并且目前也有诸多报道指出，ω-醇溶蛋白的不合理缺失可能对小麦的品质有着较大的负面效应[25-27]。因此，为了提高小麦面粉的品质，增加ω-醇溶蛋白中的含硫氨基酸明显比敲除ω-醇溶蛋白基因更有益处。本研究中获得的ω-醇溶蛋白序列中KR082150拥有了两个甲硫氨酸，因此，我们可以利用其序列设计引物扩增含硫氨基酸的ω-醇溶蛋白，一方面可以搜集更多的含硫ω-醇溶蛋白进行研究，另一方面还可以将更多的含硫ω-醇溶蛋白转入普通小麦替换贫硫ω-醇溶蛋白。

由进化树分析可知，ω-醇溶蛋白分成了2个主要的分支：以丙氨酸(Ala)开头的ω-醇溶蛋白聚在了一个大的分支中，包括ATN 、ARH、ARE和ARQ四种类型；另一个分支包括TRQ和SRL两种类型。因此，ω-醇溶蛋白的类型在进化中可能发挥着重要的作用，ω-醇溶蛋白以丙氨酸(Ala)开头的可能来源相同，这为下一步研究ω-醇溶蛋白的进化提供了研究方向。

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Cloning and Analysis of Novel ω-gliadin Sequences fromTriticumSpecies

LI Zenglin,WU Dandan,LI Hongyu,CHEN Gang,LIU Xiaojuan,NING Shunzong,LIU Dengcai,ZHANG Lianquan

(Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

Abstract:In order to exploit the potential value of ω-gliadin in wheat quality breeding,two pairs of primers were used to amplify the ω-gliadins from T. timopheevi Zhuk. var. araraticum,T.turgidum ssp. dicoccon,T. timopheevi,T.monococcum ssp. monococcum and T.monococcum var. boeoticum. Six novel ω-gliadin sequences were isolated,which belonged to three types:ARH,ATN and TRQ.The lengths of 6 sequences varied from 927 to 1 095 bp. Only KR082150 has two methionines,and the others have no cysteines and methionines.Phylogenetic analysis indicated that ω-gliadin sequences obtained in this study were mainly divided into 2 branches.The ARH and ATN types of ω-gliadin sequences were clustered together in one branch,while TRQ type of ω-gliadin sequence was clustered in the other branch.

Key words:Triticum species; ω-gliadin; Gene cloning; Phylogenetic analysis

中图分类号：S512.1；S330

文献标识码：A

文章编号：1009-1041(2016)03-0268-05

通讯作者：张连全(E-mail: zhanglianquan1977@126.com)

基金项目：国家自然科学基金项目(31271723，31201210); 四川省杰出青年基金项目(2011JQ0016); 四川省教育厅项目(14ZA0012)

收稿日期：2015-11-04修回日期：2015-12-19

网络出版时间：2016-03-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160301.1338.004.html

第一作者E-mail: qlizenglinq@163.com(李增林); wudandan90@163.com(吴丹丹,与第一作者同等贡献)