激活葡萄糖脑苷酯酶对帕金森病患者皮肤成纤维细胞自噬活性的影响

陈艳红　孙涛

442000　十堰市太和医院湖北医药学院附属医院中医康复综合部(陈艳红)；十堰市人民医院湖北医药学院附属医院泌尿外科[孙涛(通信作者)]



激活葡萄糖脑苷酯酶对帕金森病患者皮肤成纤维细胞自噬活性的影响

陈艳红孙涛

442000十堰市太和医院湖北医药学院附属医院中医康复综合部(陈艳红)；十堰市人民医院湖北医药学院附属医院泌尿外科[孙涛(通信作者)]

【摘要】目的探讨激活葡萄糖脑苷脂酶(GBA)对帕金森病患者皮肤成纤维细胞自噬活性的影响。方法取32例帕金森病患者的皮肤标本进行成纤维细胞体外培养，运用含有雷帕霉素及不含雷帕霉素的GBA培养基分别进行体外培养，用蛋白印迹法检测自噬体的经典标记物微管相关蛋白的表达。结果雷帕霉素处理后 Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白的表达水平增高(P<0．05)，而a-synuclein表达水平则下降(P<0．05)。结论激活GBA可以强化自噬水平，降低a-synuclein蛋白的表达。

【关键词】葡萄糖脑苷脂酶a-突触核蛋白自噬

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.011

帕金森病(Parkinson’ s Disease, PD)是人类常见的中枢神经系统退行性疾病之一，a-突触核蛋白(a-synuclein, a-syn)或者功能异常的细胞器(如线粒体、内质网等)的降解障碍都是导致PD发生的重要因素，有研究表明 a-突触核蛋白与葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase gene，GBA)蛋白的缺乏在PD的发病中起到了一个双向环路的作用[1]。自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway, ALP)是细胞内重要的蛋白降解途径,尤其在清除异常聚集的a-突触核蛋白中发挥着重要作用，GBA是溶酶体内的一种酶，且GBA与a-突触核蛋白可相互影响，因此有学者推测GBA在自噬、溶酶体和调控a-syn的表达中发挥着某种作用。为此，本实验旨在探讨GBA对自噬的调控及a-syn的影响。

1材料与方法

1.1实验材料及病例资料

1.1.1主要试剂及仪器鼠抗人8-Glc单克隆抗体及羊抗鼠IgG均购自上海蓝基生物公司(上海，中国)，取皮器产(日本)，酶标仪(Bio-Rad，USA)，自动洗板机(MODEL1575，USA)，台式高速离心机(TGL-16G，中国)，红外荧光扫描成像仪。

1.1.2病例资料选择2013年9月～ 2015年9月在湖北医药学院附属太和医院神经科及老年病科就诊的患者，其均符合原发性PD的标准诊断[2]。所有患者均由同一位医生间断3次评估，排除帕金森综合症。原发性帕金森病组病例组共32例，其中男17例，女15例，平均年龄(59.08±7.01)岁。

1.2方法

1.2.1标本采集取患者皮肤进行成纤维细胞培养，所有受试者均签署知情同意书。上臂背侧肘关节常规消毒皮肤，利多卡因局部浸润麻醉后用打孔机样取皮器旋取皮肤标本，置入加抗生素的的青霉素瓶中，在超净台内将标本转移到培养皿中，用眼科剪修剪，去除皮下脂肪组织，并将标本剪碎，取皮后创口消毒、压迫止血，用无菌纱布加压包扎。

1.2.2细胞培养帕金森病患者皮肤成纤维细胞用DMEM培养基、体积分数为0．10的胎牛血清、抗生素，于37℃ CO2孵箱中进行原代培养及传代培养，当细胞传代生长达到一定规模后可以将部分细胞冷冻保存备用,冻存的细胞应该处在生长良好(即处于对数生长期)且存活率高(90%以上)的状态。

1.2.3分组通过细胞计数取适量细胞，根据培养基种类分为两组，A组(不含雷帕霉素)及B组(含有雷帕霉素)。

1.2.4Western印迹杂交分析蛋白表达水平A组及B组培养成纤维细胞4 d后收集并裂解细胞，定量取蛋白行SDS-PAGE电泳后，转膜、封闭，一抗(鼠抗人8一Glc单克隆抗体，体积比为1∶500)室温作用1 h后洗膜3次，再与二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，体积比为1∶500)室温反应1 h，洗膜后行ECL光化学法显色，暗室下行x线胶片曝光，内参为GAPDH。2组Western blot蛋白条带用平均吸光度值表示。

2结果

2组皮肤成纤维细胞内源性Beclin 1、LC3-II/LC3-l、a-synuclein的表达水平

A组与B组内源性Beclin 1、LC3-II/LC3-l、a-synuclein蛋白的浓度比较有显著差异(P<0.05)；A组a-synuclein的水平[(3.869±1.292)ng/mL]明显高于对照组[(2.922±0.804)ng/mL]；A组Beclin-1的水平及LC3-II/LC3-I比值明显低于对照组(表1)。

3结论

帕金森病的患病因素包括遗传易感性、年龄、老化及环境等多种环节。有多项研究表明自噬与帕金森病有密切的联系,自噬的失调对PD的发生、发展起着重要作用,但是目前关于在PD患者活体内自噬功能的研究还很少。本研究主要通过GBA培养基激活其活性，诱导自噬,发挥其清除胞浆内异常蛋白质或细胞器的功能。

表1　2组血浆a-synuclein、Beclin 1、LC3-II/LC3-l比较

注：32例PD患者检测寡聚体水平时，其中有2例患者因其OD值小于检测范围，因无具体数值，故未纳入比较；与A组比较，*P<0.05

自噬的发生及发展的分子机制十分复杂，但却有相当高的相似性。Komatsu M通过对酵母的研究发现，高等真核生物与酵母有类似的自噬分子机制[3]。自噬体标记物有多种蛋白，其中微管相关蛋白1轻链3 (LC-3)是一种经典的标记物[4]，LC-3I(18KD)和LC-3II(16KD)是细胞内两种主要形式LC-3。一般情况下自噬激活后LC-3I就被活化，在泛素样反应酶的作用下与隣脂酰乙醇胺偶联生成LC-3II。因此,LC-3II的量与自噬小体的形成有紧密的联系,而LC-3II与LC-3I的比值是反映自噬活性的可靠指标[5-6]。因此，本实验选用观察LC3的表达水平判断PD患者皮肤成纤维细胞的自噬情况,直接观察指标为LC-3II与LC-3I的比值。本研究B组Beclin1蛋白水平明显高于A组，通过培养基激活GCA使Beclin1蛋白水平表达明显上调，同时B组LC3II/LC3-I比值也明显高于A组，由此可见激活GCA可以上调自噬水平。但B组a-syn的水平明显低于A组,提示激活GCA可以使a-syn突触核蛋白表达降低。过表达GBA一方面可以上调自噬水平；另一方面又能使突触核蛋白表达降低。其机制可能为自噬可降解异常蛋白质，这些蛋白质通常来自于诱发损伤的早期死亡细胞，或者清除异常的蛋白质和(或)失活的细胞器[7]，从而对神经元起保护作用，反过来神经细胞内的自噬被抑制后会导致神经元变性及异常蛋白质的积聚，激活GBA可促进a-syn分解代谢，低水平的a-syn又促进了GBA蛋白的活化，而GBA活性的改变反过来又加速了a-syn的清除。由此推测激活GBA可能通过自噬降低了a-syn的表达水平。

本研究结果表明，激活GBA不仅可以强化自噬水平，还可以降低a-syn的表达， PD患者活体皮肤成纤维细胞自噬功能的检测为阐明PD的发病机制提供了理论依据。另外，雷帕霉素对PD患者成纤维细胞的影响也可能为药物治疗PD提供了新的思路，但该结论及具体机制还需要扩大样本量进一步研究。

参考文献

[1]Tan EK,Tong J,Fook-Chong S,et al.Glucocerebrosidase mutations and risk of Parkinson disease in Chinese patients[J].Arch Neurol,2007,64(7):1056-1058.

[2]吴江.神经病学[M].北京:人民卫生出版社,2005.

[3]Komatsu M,Waguri S,Chiba T,et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice[J].Nature,2006,441(795):880-884.

[4]Tanida I,Ueno T,Kominami E.LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2503-2518.

[5]Bursch W.The autophagosomal-Iysosomal compartment in programmed cell death[J].Cell Death Differ,2001,8(6):569-581.

[6]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J].Cell,2010,140(3):313-326.

[7]pan T,Rawal P,Wu Y,et al.Rapamycin protects against rotenone-induced apoptosis through autophagy induction[J].Neuroscience,2009,164(2):541-551.

(2015-12-16收稿2016-03-02修回)

Effect of activation of glucocerebrosidase on autophagotrophic activity of skin fibroblasts in Parkinson's patients

ChenYanhong,SunTao.

DepartmentofGeriatrics,TaiheHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan442000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of activation of glucocerebrosidase on autophagotrophic activity of skin fibroblasts in Parkinson's patients. Methods32 cases of Parkinson's disease were selected. Fibroblast cells were cultured in vitro with rapamycin or without rapamycin GBA culture medium respectively. Microtubule associated protein phage classic markers expression were detected by protein imprintting method. ResultsBeclin 1 and LC3 - Ⅱ/LC3 - I protein expression level increased (P<0.05), while a - synuclein expression level decreased (P<0.05). ConclusionGBA activity can strengthen autophagy and reduce a - synuclein protein expression.

【Key words】Glucocerebrosidasea-synucleinAutophagy

【中图分类号】R742.5

【文献标识码】A

【文章编号】1007-0478(2016)02-0114-03

基金项目：2015年湖北省教育厅科学研究计项目划指导性(项目编号为B2015473)