益气活血中药对脂多糖致急性肺损伤大鼠的防治作用

秦丽　王毓国　李敏　窦永起

100853 北京，中国人民解放军总医院中医科[秦丽(硕士研究生)、王毓国、李敏、窦永起]



益气活血中药对脂多糖致急性肺损伤大鼠的防治作用

秦丽王毓国李敏窦永起

100853 北京，中国人民解放军总医院中医科[秦丽(硕士研究生)、王毓国、李敏、窦永起]

【摘要】目的观察益气活血中药对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)大鼠的防治作用，并初步探讨其作用机制。方法SD雄性大鼠40只，随机分成正常对照组、模型对照组、地塞米松组、益气活血中药治疗组、益气活血中药防治结合组，每组8只；除正常对照组行气管内滴注生理盐水，其余各组均滴注LPS(5 mg/kg)制备ALI大鼠模型；造模前后各3天干预组予以2 mL相应药物(益气活血中药0.59 g/mL；地塞米松5 mg/kg)，其余组予以等量的生理盐水灌胃。观察大鼠的呼吸、精神等一般活动；于末次灌胃给药2小时后处死大鼠，测定大鼠肺湿重/干重(W/D)比值，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中总蛋白含量，及光镜下观察肺组织病理学改变。结果LPS造模组大鼠肺W/D比值、BALF中蛋白浓度及肺组织中肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6含量均高于正常对照组(P<0.01)，且模型对照组高于地塞米松组和中药治疗组、中药防治结合组(P<0.05)，治疗组高于防治组(P<0.05，P<0.01)；地塞米松组W/D比值及肺组织中TNF-α、IL-1β含量与中药防治组无明显差异(P>0.05)。结论益气活血中药能够降低LPS致ALI大鼠BALF中蛋白含量及肺组织中炎症因子的含量，减轻肺水肿和肺组织的病理损伤，起到防治急性肺损伤的作用。

【关键词】益气活血中药；急性肺损伤；脂多糖

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是感染、创伤等病因下出现的以进行性呼吸困难、顽固性低氧血症和肺水肿为主要表现的临床综合征。ARDS是ALI的严重阶段，为临床常见的急危重症，由于其发病机制复杂，治疗效果不佳，其病死率仍然居高不下，平均病死率高达50%以上[1]。课题组既往研究[2]表明益气活血中药通过促进血液中血管活性多肽降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)的合成与释放、抑制血管收缩因子内皮素-1(endothelin，ET-1)的生成及释放，从而扩张血管、减轻肺水肿、改善肺循环，发挥对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致ALI大鼠的防护作用。本研究通过益气活血中药干预LPS诱导的ALI大鼠，观察支气管肺泡灌洗液中蛋白和肺组织中炎症因子的变化，初步探讨益气活血法防治ALI的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

选用两月龄健康清洁级SD雄性大鼠40只，体质量为(200±20) g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)：2012-0004。

1.2药物制备

益气活血中药由生黄芪和丹参组成，两者用量比例为2∶1，中药材由解放军总医院中药房采购及鉴定，经过浸泡、煎煮和过滤后，在恒温水浴锅(60℃)中浓缩成含生药量为0.59 g/mL的药液(按大鼠与人体体表面积换算公式计算[3])。

1.3主要试剂和仪器

脂多糖，购自Sigma公司，批号：L2880；戊巴比妥钠，购自Germany公司，批号：K2208；BCA法蛋白定量试剂盒，购自北京普利莱公司，批号：201308；大鼠肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α(Andygene，批号：HTLN30633)、白介素(interleukin,IL)-1β(Andygene，批号：HTCL30418)、IL-6(Andygene，批号：HTLC30649)ELISA试剂盒。

多功能酶标仪(VICTOR X5)，购自PerkinElmer有限公司；旋转蒸发器(RE53CS)，购自上海亚荣生化仪器厂；切片机(莱卡2016)，购自上海莱卡仪器有限公司；包埋机，购自湖北孝感亚鹏仪器厂；台式冷冻离心机(1-15K)，购自SIGMA公司；电热恒温箱(DHG-9240A)，购自北京陆希科技有限公司。

1.4动物分组及处理方式

SD雄性大鼠40只，随机分成正常对照组、模型对照组、地塞米松组、益气活血中药治疗组、益气活血中药防治结合组，每组8只。中药防治结合组(简称中药防治组)大鼠在造模前3天每天予以益气活血中药2 mL灌胃(1次/d，含生药量0.59 g/mL)，其余组大鼠每天予以同体积的生理盐水。在造模成功后，益气活血中药治疗组(简称中药治疗组)和中药防治组大鼠每天予以2 mL益气活血中药(0.59 g/mL)灌胃，地塞米松组大鼠每天予以2 mL地塞米松溶液(5 mg/kg)灌胃，正常对照组和模型对照组大鼠每天予以等量的生理盐水灌胃，1次/d，连续给药3天。

1.5制备ALI大鼠模型

采用LPS暴露式气管滴注方法制备ALI模型[4]。除正常对照组外，其余各组均给予气管内滴注LPS溶液(5 mg/kg)。造模过程：无菌环境下，采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射进行大鼠麻醉，固定大鼠于仰卧位，正中切开颈部组织，使气管暴露，用1 mL注射器由气管向肺方向滴注LPS溶液，而后将大鼠直立、旋转并左右摇晃，使LPS溶液在肺内均匀分布，从而建立内毒素性急性肺损伤大鼠模型。正常对照组大鼠按上述方法向气管滴入等量的生理盐水。

1.6标本取材与观测指标

1.6.1一般情况造模后观察各组大鼠的呼吸频率、自主活动、精神状况和唇爪颜色等情况。

1.6.2大鼠支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度的测定所有大鼠在造模灌胃后第3天麻醉称重，处死后剪开胸部和颈部皮肤，暴露胸腔；结扎大鼠右主支气管后，在主气管上插入导管至下端分叉处，注入磷酸盐缓冲液2 mL进行左肺灌洗，反复3次，总回收量约为5.5 mL；将收集的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行4℃离心，3000 rpm，15分钟，取上清液。采用BCA法检测BALF中总蛋白浓度，操作严格按试剂盒说明书进行。反应终止后，用酶标仪562 nm观测密度(OD)值，绘制标准曲线，用Excel拟合曲线计算蛋白浓度。

1.6.3大鼠肺湿重/干重(W/D)比值取右肺上叶组织，用滤纸吸走表面附着的水分与血渍，称得湿重(wet weight，W)后将其置于60℃恒温箱中72小时至重量不再改变，取出称得干重(dry weight，D)，计算W/D比值。

1.6.4大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的测定称取右肺中叶，以每100 mg组织加入生理盐水1 mL，在冰上用匀浆器匀浆，4℃、 3000 rpm、 15分钟，低温离心取上清液，采用双抗体夹心酶联免疫(ELISA)法，严格按试剂盒说明书方法进行TNF-α、IL-1β、IL-6因子浓度的检测。反应终止后选择 450 nm波长，检测相应的OD值，计算相应的浓度。

1.6.5肺组织大体情况和病理学观察 取材时肉眼观察双侧肺组织表面色泽、包膜完整性、水肿情况及有无出血点等。并取右肺下叶组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定48小时后，进行脱水、透明和石蜡包埋并作4 μm厚切片，然后进行苏木精-伊红染色，光镜下观察大鼠肺组织的病理形态改变。1.7统计学处理

2结果

2.1各组大鼠一般状况

正常对照组大鼠生理盐水造模及麻醉缓解后呼吸尚平稳，对外界刺激反应正常。而气管滴注LPS造模大鼠，2小时内呼吸急促并发出喘鸣音，且精神萎靡、反应迟钝、自主活动减少、四肢和口唇发绀；随后至4小时内模型对照组大鼠精神仍然萎靡、无进水进食，而防治组大鼠呼吸平稳、自主活动开始恢复。

2.2大体观察及光镜下观察各组大鼠肺组织

正常对照组大鼠双侧肺组织色泽呈淡粉红色，包膜完整、弹性好，表面无出血点，胸腔内无液体渗出；光镜下显示肺组织结构正常，肺泡结构清晰完整，肺泡间隔无水肿，肺泡腔内有渗出液或炎性细胞。见图1A。

模型对照组双侧肺叶呈暗红色，充血水肿明显，表面可见紫红色斑块或点片状出血，胸腔内有渗出液；光镜下观察肺组织结构破坏严重，肺间质弥漫性充血水肿，肺泡腔内有大量的中性粒细胞浸润。见图1B。

A正常对照组；B 模型对照组；C地塞米松组；D 中药治疗组；E 中药防治组

地塞米松组和中药组双侧肺叶轻度充血，局部肺叶表面可见散在的出血点，肺叶弹性良好，胸腔内有少量稀薄的渗出液；光镜下肺结构损伤较模型对照组明显减轻，且中药防治组改善情况最为明显，肺间质轻度充血水肿，内有少量中性细胞浸润。见图1C、D、E。

2.3各组大鼠肺湿重/干重(W/D)比值

与正常对照组比较，其余组大鼠肺组织W/D比值明显升高(P<0.01)；与模型对照组比较，地塞米松组和中药组均有下降(P<0.01)；中药防治组较中药治疗组低(P<0.05)，而与地塞米松组间无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.4各组大鼠BALF中蛋白浓度

与正常对照组比较，其余组大鼠BALF中蛋白浓度均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，药物干预组BALF中蛋白浓度均降低(P<0.01)；中药治疗组BALF中蛋白浓度高于中药防治组(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠肺W/D比值及BALF中

注： 与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组比较，cP<0.05，dP<0.01；与地塞米松组比较，eP<0.05 ，fP<0.01；与中药治疗组比较，gP<0.05，hP<0.01。

2.5各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度

与正常对照组比较，其余组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，药物干预组中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.01)；地塞米松组与中药防治组TNF-α、IL-1β浓度无明显差异(P>0.05)，而中药治疗组TNF-α、IL-1β、IL-6低于中药防治组(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2　各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的

注： 与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组比较，cP<0.05，dP<0.01；与地塞米松组比较，eP<0.05 ，fP<0.01； 与中药Ⅰ组比较，gP<0.05，hP<0.01。

3讨论

LPS诱导内毒素型ALI大鼠模型的制备运用较广，有腹腔注射、尾静脉注射、气管滴入等方法[5]，其中气管滴入法可直接造成肺的损伤。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，损伤肺泡—毛细血管膜，使其通透性增加，血管内漏致使肺水肿；Ⅱ型肺泡细胞损伤，表面活性物质合成减少，肺张力减小致肺不张。从而出现肺容积减少、通气/血流比例失调、氧合指数和肺顺应性降低，从而出现低氧血症和呼吸窘迫，即ALI。本研究采用LPS(5 mg/kg)气管滴入法制备ALI大鼠模型，通过观察到大鼠呼吸、精神等一般情况的改变，肺组织大体和镜下病理改变，属于ALI的典型表现；检测肺 W/D 比值、BALF中蛋白浓度和肺组织中炎症因子含量，反应了ALI的严重程度及药物干预后的改善情况。

ALI属于中医“喘证”范畴，该病表现为“气亏耗不足以息而喘”，病理基础为肺不主气、肺失宣降，病机关键是虚、湿、瘀、热[6]。肺为娇脏，易感外邪，在六淫、疫毒等外邪作用下导致肺气受损、宣降失司；肺为水之上源、通调水道，气虚较重不能行水故水湿内停；肺朝白脉，气为血之帅，气虚血行不利故肺脉瘀阻。根据主要病机笔者采用益气活血中药黄芪、丹参防治ALI，且课题组既往临床研究[7]表明益气活血中药能改变肺循环高凝状态，降低血液黏度，减轻患者气管黏膜充血、水肿，使炎性反应显著改善，并通过抑制中性粒细胞在肺组织中的渗出显著减轻肺的直接和继发损伤。

ALI/ARDS是炎症反应失控的结果，TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子参与了炎症反应、组织损伤的过程[8-9]，TNF-α 是ALI最重要的启动因子，能够刺激氧自由基、蛋白溶解酶的大量释放，趋化中性粒细胞在肺内聚集、粘附，导致肺泡-毛细血管损伤，其可反应肺组织损伤的严重程度[10-12]；IL-1β主要由单核-巨噬细胞产生，是急性反应的主要调节物质，能诱导IL-6、IL-8等产生，且IL-6是强有力的促炎因子，能够放大肺部的炎症反应[12-15]。故本研究亦从炎症角度观察益气活血中药对ALI的防治作用，其结果显示：LPS造模后肺组织中炎症因子含量均明显升高，而地塞米松组和中药治疗、防治组较模型对照组显著降低，提示一定的药物干预可以有效地降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，减轻肺部的炎症反应；中药防治组TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于中药治疗组，说明益气活血中药防治结合较单纯治疗具有更好的疗效；光镜下模型对照组肺组织出现明显充血、水肿、炎性细胞浸润及肺间隔增宽等典型的ALI病理改变，而药物干预能够改善其病变程度；肺W/D比值可反应肺水肿的严重程度，BALF中蛋白浓度可反映肺脏血气屏障的通透性，药物组均较模型对照组降低，说明益气活血中药能减少蛋白漏出，改善肺水肿的状况，且防治结合效果更好。

综上所述，本研究结果表明益气活血中药对LPS致ALI大鼠具有防治作用，其可改善肺组织的病变程度，减轻炎症反应，且早期药物干预有助于ALI的预后。其机制可能与其降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平有关，这可为益气活血法在临床上防治内毒素型ALI提供一定思路，但关于益气活血中药对ALI防治作用分子机制尚不明确，有待进一步研究。

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(本文编辑： 韩虹娟)

Preventive effect ofYiqiHuoxuerecipe on lipopolysaccharide induced acute lung injury in rats

QINLi,WAGNYu-guo,LIMin,etal.

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the preventive effect of Yiqi Huoxue recipe on acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS), and explore its mechanism.MethodsForty healthy male SD rats were randomly divided into normal control group, model control group, dexamethasone group, herbs treatment group, herbs prevention group, eight rats in each group. ALI models were established by intratracheal instillation of LPS (5 mg/kg) while normal control group was instilled normal saline. 3 days before and after making the model，the drug(0.59g/mL herbs or dexamethasone for 5mg/kg)or same amount of normal saline was given by gavage in each group，and observe their respiration, activity and so on. Rats were sacrificed after 2h of the last administration. Then the lung wet weight / dry weight (W/D) ratio and the protein content in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was measured, and the pathological changes in lung tissues．ResultsCompared with normal control group, LPS groups exhibited a higher level of the lung W/D weight ratio, the protein content in BALF and the content of TNF-α, IL-1β, IL-6 in lung tissue (P<0.01); compared with model control group, the indexes in dexamethasone group and herbs group were decreased (P<0.01); compared with herbs treatment group, the indexes in herbs prevention group were decreased (P<0.01 or P<0.05); the lung W/D weight ratio, the content of TNF-α, IL-1β between dexamethasone group and herbs prevention group were close (P>0.05). ConclusionYiqi Huoxue recipe can reduce the contents of inflammatory cytokines and protein content in BALF of LPS induced ALI rats, reduce the pathological damage of lung tissue and pulmonary edema, have the effect of prevention and treatment of acute lung injury.

【Key words】Yiqi Huoxue recipe；Acute lung injury；Lipopolysaccharide

(收稿日期：2015-12-04)

Corresponding author:DOU Yong-qi, E-mail: dyqi_301@yeah.net

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.007

作者简介：秦丽(1990- )，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：中西医结合临床。E-mail：qinlizi301@163.com通讯作者： 窦永起(1965- )，硕士，主任医师，教授，博士生导师。研究方向：中西医结合临床。E-mail：dyqi_301@yeah.net

基金项目：国家自然科学基金(81303131)