补益类复方中药调控流感病毒样颗粒免疫小鼠外周血白细胞介素17A的表达水平

林巧　邱勇龙　侯杏芳　郑军　张国良　曾进　刘映霞　聂广

518126　深圳市宝安区慢性病防治院综合门诊(林巧、邱勇龙、郑军、曾进)；深圳市第三人民医院肝病研究所(侯杏芳、张国良、刘映霞、聂广)



·论著·

补益类复方中药调控流感病毒样颗粒免疫小鼠外周血白细胞介素17A的表达水平

林巧邱勇龙侯杏芳郑军张国良曾进刘映霞聂广

518126深圳市宝安区慢性病防治院综合门诊(林巧、邱勇龙、郑军、曾进)；深圳市第三人民医院肝病研究所(侯杏芳、张国良、刘映霞、聂广)

【摘要】目的探讨补益类复方中药对流感病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)免疫小鼠外周血白细胞介素17A(interleukin 17A，IL-17A)表达的影响。 方法将42只BALB/C小鼠随机分为VLPs组、VLPs+益气方组、VLPs+补血方组、VLPs+滋阴方组、VLPs+壮阳方组、VLPs+霍乱毒素组和PBS组共7组，每组6只，分别于0和14天通过鼻腔使用VLPs(10 μg/次)进行免疫，联合中药组在第1至第13天连续灌服中药。中药佐剂按生药量200 mg/kg剂量接种。在免疫第0天、13天及28天采集外周血并分离血浆和单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组外周血浆IL-17A浓度，利用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay，Elispot)检测PBMC中分泌IL-17A的细胞数, 即斑点形成集落数(spot forming cells，SFCs)。 结果(1)无论是在免疫应答早期还是后期，VLPs能有效诱导外周血浆中IL-17A的分泌，而联合益气方组血浆中IL-17A水平进一步提高(P<0.05)；(2) Elispot技术能有效检测PBMCs中分泌IL-17A的阳性细胞。与单纯VLPs免疫组相比，益气方和滋阴方均能显著增加分泌IL-17A的细胞数(P<0.01)，在免疫后28天尤为明显。 结论益气方、滋阴方可以显著增强流感VLPs诱导的IL-17A表达水平，益气联合滋阴方有望成为新型流感疫苗佐剂。

【关键词】补益类复方中药；流感；病毒样颗粒；白细胞介素-17A

由于流感病毒通过抗原漂移和抗原转变的形式产生免疫逃逸[1]，目前临床上应用的流感疫苗并不能满足多种亚型流感病毒，因此增强疫苗免疫原性、寻找安全高效的疫苗佐剂成为当今研究热点。白细胞介素17A(interleukin 17A，IL-17A)是主要由辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)细胞分泌的具有多种生物学效应的细胞因子，可以诱导机体产生多种细胞因子、趋化因子、炎症效应物质和抗微生物蛋白，在天然免疫和宿主防御中发挥重要作用。研究证实IL-17信号通路缺失的小鼠对利什曼原虫感染更为易感[2]，同时A型流感病毒可以抑制Th17细胞介导的宿主抗细菌免疫应答[3]。

既往研究表明多种中草药具有多方面的免疫活性，能影响和调节机体的免疫功能，尤其是补益类中药[4]。前期实验中课题组也发现补益类复方中药能够增强流感病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)疫苗免疫原性，但其对免疫小鼠IL-17A应答水平的影响尚不清楚。为此本研究检测不同中药联合VLPs免疫方案诱导小鼠产生特异性IL-17A分泌水平的差异，进一步明确补益类中药作为佐剂发挥免疫调节作用的分子机制，为临床应用补益类复方中药佐剂奠定理论基础。

1材料和方法

1.1实验动物

BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2014-0035，共42只，雌性，6～8周龄，体质量(20.5±2.3) g，饲养于深圳市第三人民医院SPF级动物实验室。

1.2试验药物

本研究分别以益气、养血、滋阴、壮阳为组方原则，制备不同种类补益类复方中药，其中益气方由党参20 g、黄芪10 g、茯苓10 g组成；养血方由当归15 g、白芍15 g、制首乌10 g组成；滋阴方由麦冬15 g、枸杞15 g、石斛10 g组成；壮阳方由淫羊藿15 g、补骨脂10 g、怀牛膝10 g组成(以上中药量均为生药量)。中药免煎颗粒剂购自广东一方制药公司，生产批号：140813，1 g/袋，分别相当于生药量为：党参10 g、黄芪10 g、茯苓10 g、当归10 g、白芍10 g、制首乌5 g、麦冬10 g、枸杞10 g、石斛10 g、淫羊藿5 g、补骨脂5 g、怀牛膝10 g。以霍乱毒素(cholera toxin，CT)作为黏膜佐剂阳性对照，PBS作为空白对照组灌服试剂。

1.3试剂与仪器

小鼠淋巴细胞分离液(DKW33-R0100)购自深圳达科为生物公司;DMEM(12491-015)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，10437-028)均购自美国Gibco公司;IL-17A酶联免疫检测试剂盒(M1700)购自美国R&D公司;IL-17A单克隆包被抗体(sc-374218)、生物素标记二抗(sc-7927)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(sc-2004)均购自美国Santa Cruz公司;流感VLPs疫苗由课题组前期自行制备[5]，多功能酶标仪和CO2细胞培养箱为美国Thermo Fisher公司产品;Elispot读数系统购自德国AID公司。

1.4模型制备和观察指标

1.4.1免疫方案制定及血浆、外周血单核细胞的制备应用随机数字表法将42只小鼠分为VLPs组、VLPs+益气方组、VLPs+养血方组、VLPs+滋阴方组、VLPs+壮阳方组、VLPs+霍乱毒素组和PBS组7组，每组6只。于第0和14天通过鼻腔以10 μg/次剂量进行流感VLPs免疫。在第1天至第13天，VLPs+益气方组、VLPs+养血方组、VLPs+滋阴方组、VLPs+壮阳方组每天通过灌胃的方式分别灌入益气方、补血方、滋阴方及壮阳方，中药按生药量200 mg/kg剂量接种，灌胃体积按0.2 mL/10g体重计算，霍乱毒素按1 μg/次接种。分别于0天(免疫前)、13天(最后一次服用中药)及28天采集各组小鼠外周肝素锂抗凝血[6]，离心获得血浆，-80℃保存，剩余细胞采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞((peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，冻存于液氮中备用。

1.4.2利用ELISA检测血浆中IL-17A水平根据IL-17A ELISA试剂盒说明书，首先向酶标板中加入100 μL Assay Diluent活化抗体，之后加入100 μL血清室温孵育3小时，PBST洗涤3次后，加入200 μL酶标二抗室温孵育1小时，PBST洗涤3次后加入200 μL底物进行显色，然后使用多功能酶标仪测定450 nm吸光度。最后根据标准曲线将样品OD值换算为蛋白浓度。

1.4.3利用Elispot检测PBMCs中分泌IL-17A的细胞数使用包被缓冲液将抗鼠IL-17A特异性单克隆抗体稀释为3 μg/mL，向96孔板中加入100 μL/孔，4℃过夜。将各组免疫小鼠PBMCs按1.0×105/孔铺板，同时加入终浓度为2 μg/mL的VLPs进行刺激，37℃、5% CO2条件下培养36小时，PBST洗涤3次，随后加入生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标记的亲和素，底物显色后根据形成的斑点数判断细胞因子表达水平的高低。待显色洗板后, 在Elispot读数系统自动读数, 并记录斑点形成集落数。

1.5统计学处理

2结果

2.1补益类复方中药对VLPs免疫小鼠血浆中IL-17A表达水平的影响

免疫后第13天，VLPs及VLPs联合中药均能诱导小鼠外周血浆中IL-17A表达，其中益气方组IL-17A浓度为(59.8±9.0)ng/mL，表达水平最高，与单纯VLPs组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫后第28天，VLPs及VLPs联合中药组IL-17A表达水平进一步提高，仍以益气方组升高最为明显，高达(75.3±8.4)ng/mL，显著高于单纯VLPs组(P<0.01)。无论是在免疫早期还是免疫后期，其他联合中药组与单纯VLPs组差异无统计学意义，结果见表1。

2.2补益类复方中药对VLPs免疫小鼠PBMCs中分泌IL-17A细胞数的影响

由于外周血浆中IL-17A水平较低，而Elispot技术是检测PBMCs中分泌IL-17A的细胞数，其斑点数代表IL-17A阳性细胞数，与ELISA技术相比，敏感性、特异性更佳。如图1所示，不同免疫方案的PBMCs中IL-17A斑点形成集落数存在显著差异。

通过统计分析，发现在免疫后第13天和第28天，益气方组和滋阴方组均能显著提高IL-17A斑点形成集落数，与单纯VLPs组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。而养血方和壮阳方对IL-17A斑点形成集落数影响不显著，差异无统计学意义，结果见表2。

表1　不同免疫方式的BALB/C小鼠在不同时间点

注： 与VLPs组相比，aP<0.05，bP<0.01。

表2　不同免疫方式的BALB/C小鼠在不同时间点

注： 与VLPs组相比，aP<0.01。

3讨论

IL-17主要是由Th17细胞分泌的细胞因子，该家族包括6个成员的配体(IL-17A～IL-17F)和5个受体(IL-17RA～IL-17RD和SEF)，是最近新发现的具有强大的促炎症作用的细胞因子家族，能诱导各种免疫反应来对抗病原体，因此它具有抗感染和促炎症双重功能[7]。如Yamazaki等[8]研究显示IL-17A与皮肤黏膜的白色念珠菌感染有关，白色念珠菌病疾病患者体内IL-17 A表达水平减少。IL-17A也与细菌感染有关，Montgomery等[9]研究发现IL-17A在金黄色葡萄球菌皮肤感染中具有保护作用。

另外也有研究发现，在支气管腺病毒感染的小鼠模型中，IL-17A能募集中性粒细胞，但是缺乏抑制病毒复制的作用[10]。以上研究表明IL-17A在各类感染性疾病的发生、发展和转归中扮演重要角色。

中药能促进造血细胞生成，促进IL-1、IL-2、IL-12、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 、 干扰素

图1　Elispot技术检测各组免疫小鼠外周血PBMCs 中IL-17A斑点形成集落数

(interferon，IFN)等细胞因子的分泌，刺激、加强细胞因子的作用，增强机体的细胞免疫和体液免疫，活化补体，提高机体的免疫功能，产生免疫调节作用。另外中药还能有效激活T细胞，如枸杞多糖、女贞子多糖、黄芪多糖可以增强辅助性T细胞功能，具有类似胸腺素样的免疫调节作用[11]。既往研究报道复方中药能够调节IL-17A的产生，如李学良等[12]研究发现宣肺固本中药能够降低哮喘模型大鼠外周血IL-17A的表达，Wang等[13]的研究表明补肾益气类中药能显著降低慢性阻塞性肺病患者体内的IL-17A表达，从而缓解肺脏局部炎症反应，但是中药能否有效调控流感VLPs诱导的免疫应答尚不清楚。

在本研究中，课题组以中医益气、养血、滋阴、壮阳为组方原则，每种处方选取3种代表性药物，然后协同流感VLPs疫苗免疫BALB/C小鼠，通过ELISA和Elispot两种实验技术检测免疫小鼠外周血浆和PBMCs中IL-17A的表达情况，发现益气方可以显著提升小鼠外周血浆中的IL-17A水平(P<0.05)，而对于胞内的IL-17A表达，益气方和滋阴方均能显著提升(P<0.01)。以上结果提示，滋阴方可以在细胞水平增加IL-17A表达，而益气方则不仅可以增加细胞内IL-17A表达，更能有效促进IL-17A的分泌，从而介导更广泛的免疫应答。因此益气联合滋阴有望成为作为新型的免疫佐剂，从而提高流感VLPs疫苗的免疫保护效果。

然而本研究仍需要通过其他实验进一步完善，首先是益气方和滋阴方究竟通过什么调控机制影响IL-17A表达？是促进IL-17A转录因子RORγt表达，还是抑制调节性T细胞功能？其次究竟是哪一类单体成分发挥有效作用，进而促进IL-17A表达？最后是IL-17A具有抗微生物和促炎双重作用，过度产生IL-17A是否对机体产生病理损害？究竟在什么浓度范围之间才能到达最佳免疫效果？以上研究内容将是本课题组下一步的工作重点。

参考文献

[1]Su S，Bi Y，Wong G，et al. Epidemiology，evolution，and recent outbreaks of avian influenza virus in China [J]. J Virol，2015，89(17)：8671-8676.

[2]Nascimento MS, Carregaro V, Lima-Junior DS, et al. Interleukin 17A acts synergistically with interferon γ to promote protection against Leishmania infantum infection [J]. J Infect Dis，2015，211(6)：1015-1026.

[3]Kudva A, Scheller EV, Robinson KM, et al. Influenza A inhibits Th17-mediated host defense against bacterial pneumonia in mice [J]. J Immunol，2011,186(3)：1666-1674.

[4]祝峥，胡云章，钱子刚. 补益类中药有效成分作为新型人用疫苗佐剂的应用前景[J]. 生物技术通讯，2004，15(1)：92-94.

[5]林巧，邹容容，张国良，等. 基于果蝇S2系统的流感病毒样颗粒的制备及鉴定[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2015，29(4)：357-360.

[6]Bright RA，Carter DM，Daniluk S，et al. Influenza virus-like particles elicit broader immune responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin [J]. Vaccine，2007，25(19)：3871-3878.

[7]Miyazaki Y，Hamano S，Wang S，et al. IL-17 is necessary for host protection against acute-phase Trypanosoma cruzi infection [J]. J Immunol，2010，185(2)：1150-1157 .

[8]Yamazaki Y，Yamada M，Kawai T，et al. Two novel gain-of-function mutations of STAT1 responsible for chronic mucocutaneous candidiasis disease：impaired production of IL-17A and IL-22，and the presence of anti-IL-17F autoantibody [J]. J Immunol，2014，193(10)：4880-4887.

[9]Montgomery CP，Daniels M，Zhao F，et al. Protective immunity against recurrent Staphylococcus aureus skin infection requires antibody and interleukin-17A [J]. Infect Immun，2014，82(5)：2125-2134.

[10]McCarthy MK，Zhu L，Procario MC，et al. IL-17 contributes to neutrophil recruitment but not to control of viral replication during acute mouse adenovirus type 1 respiratory infection [J]. Virology，2014，5：259-267.

[11]王学宏，李明春. 中药多糖的免疫及抗肿瘤作用研究进展[J]. 齐鲁医学杂志，2000，15(3)：230-231.

[12]李学良，许朝霞，钱鹏，等. 宣肺固本中药对哮喘大鼠血清IL-17、IL-22的影响[J]. 中华中医药杂志，2014，29(2)：598-601.

[13]Wang G，Liu B，Cao Y，et al. Effects of two Chinese herbal formulae for the treatment of moderate to severe stable chronic obstructive pulmonary disease：a multicenter，double-blind，randomized controlled trial [J]. PLoS One，2014，9(8)：e103168.

(本文编辑： 韩虹娟)

Regulating effect of tonic herbal compound in IL-17A expression induced by influenza virus-like particles in peripheral blood of immune mice

LINQiao，QIUYong-long，HOUXing-fang，etal.

Departmentofoutpatient，ShenzhenBao’anChronicDiseasesPreventandCureHospital，Shenzhen518126，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the regulating effects of tonic herbal compound on the IL-17A expression induced by influenza virus-like particles in peripheral blood. Methods42 BALB/C mice were divided into 7 groups(n= 6 for each group)，involving single VLPs group，VLPs combined Yiqi recipe，VLPs combined Buxue recipe，VLPs combined Ziyin recipe，and VLPs combined Zhuangyang recipe group，VLPs combined cholera toxin group was considered as positive control，and PBS only group was considered as blank control. The mice were immunized with 10μg VLPs each time through intranasal administration in day 0 and 14，and herbs were intragastric administration with 200 mg/Kg from first day to day 13. The blood was collected to make serum and PBMCs at pre-immunization and day 13 and day 28 after immunization. The IL-17A level in serum was determined by ELISA，and spot forming cells(SFCs)of IL-17A were determined using Elispot assay. Results(1)No matter in the early stage or late stage，influenza VLPs could induce IL-17A expression in serum，especially，Yiqi recipe could increase IL-17A level compared to single VLPs group(P<0.01).(2)Elispot technology can effectively detect the secretion of IL-17A positive cells in PBMCs. The SFCs of IL-17A was much higher in the Yiqi recipe and Ziyin recipe(P<0.01)，especially at day 28 after immunization. ConclusionYiqi recipe and Ziyin recipe can effectively increase IL-17A expression induced by influenza VLPs，which could be considered as new type adjuvants for influenza vaccine.

【Key words】Tonic herbal compound；Influenza；Virus-like Particles；IL-17A

(收稿日期：2016-02-02)

Corresponding author：LIN Qiao，E-mail：qlin021@aliyun.com

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.008

作者简介：林巧(1978- )，硕士，副主任中医师。研究方向：感染病中西医结合诊治研究。E-mail：qlin021@aliyun.com

基金项目：深圳市科技计划(JCYJ20140411141712839)