液相色谱质谱联用同时测定藏茵陈中的6种有效成分

李 玥，邹爱英

(1.天津市滨海新区大港中医医院，天津 300193； 2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300151)

李 玥1，邹爱英2

(1.天津市滨海新区大港中医医院，天津 300193； 2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300151)

目的：分析藏茵陈甲醇提取物中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸6种有效成分。方法：高效液相色谱-电喷雾/离子阱质谱法(HPLC-ESI/MS)对藏茵陈甲醇提取物中6种有效成分进行测定和色谱峰的归属。采用ACCHROM Unitary-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以水(4 mmol/L 甲酸铵-0.2%的甲酸)-甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，体积流量 0.8 ml/min，进样量 20 μl，柱温40 ℃；采用电喷雾离子源进行正离子模式监测。结果：藏茵陈甲醇提取物中6种有效成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸分别在1.452～29.04、0.808～16.16、1.036～20.72、0.864～17.28、0.828～16.56和5.812～116.24 μg/ml范围内具有良好的线性关系，平均回收率分别为100.1%(RSD为1.41%)、99.7%(RSD为1.49%)、98.1%(RSD为1.69%)、101.7%(RSD为1.69%)、100.1%(RSD 1.62%)、100.3%(RSD 1.64%)。结论：本法简便、快速、灵敏度高、专属性好，可用于藏茵陈甲醇提取物中6种有效成分的测定。

藏茵陈，HPLC-MS，獐牙菜苦苷，龙胆苦苷，芒果苷，swertia，svinertia，齐墩果酸

藏茵陈是传统藏药，藏药名“蒂达”，具有清热解毒，清肝利胆的功效。现代药理研究表明，藏茵陈具有保肝、抗病毒、抗菌、消炎等多种作用，临床上广泛用于治疗乙肝、急性黄疸型肝炎等疾病。藏茵陈中含有环烯醚萜、呫吨酮、三萜等多种类别的化学成分[1]。藏茵陈来源广泛，《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》(第一册)收载其原植物有川西獐牙菜SwertiamussotiiFranch和印度獐牙菜S.chirayitaKarsten。其中，藏茵陈为龙胆科獐牙菜属植物印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb ex Flemi) Karsten 的干燥全草；主产于尼泊尔、印度、不丹，多从尼泊尔由民间进入我国。藏茵陈中的齐墩果酸对四氯化碳引起的大鼠急慢性肝损伤有明显保护作用；环烯醚萜类成分具有抗炎、促进肝损伤细胞修复等药理活性。而黄酮类化合物具有抑制单胺氧化酶、抑制体外肿瘤细胞生长、抗氧化、保肝等多重活性[2-10]。

本实验采用高效液相色谱-电喷雾/离子阱质谱法(HPLC-ESI/MS)，对藏茵陈甲醇提取物中齐墩果酸、svinertia、swertia、芒果苷、龙胆苦苷和獐牙菜苦苷6种有效成分首次进行同时测定，可为藏茵陈的质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

美国Finnigan 公司 LCQ 液相色谱-质谱联用仪，ACCHROM Unitary-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，DL-360D 智能超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；BP211D型十万分之一天平(德国 Sartorius 公司)；甲醇为色谱纯(天津康科德科技发展有限公司)。獐牙菜苦苷对照品(批号110785-201404，质量分数98.3%，中国食品药品检定研究院)；龙胆苦苷对照品(批号110770-201515，质量分数99.1%，中国食品药品检定研究院)；芒果苷对照品(批号111607-200402，质量分数100%，中国食品药品检定研究院)；swertia对照品(质量分数为99.3%，自制)；svinertia对照品(质量分数为99.1%，自制)；齐墩果酸对照品(批号110709-201206，质量分数94.9%，中国食品药品检定研究院)； 5批药材均购于青海地区，经张铁军研究员鉴定为印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb ex Flemi) Karsten。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为ACCHROM Unitary-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相为水(4 mmol/L甲酸铵-0.2%的甲酸，A)-甲醇溶液(B)，梯度洗脱：0～7.0 min，95% A；7.1～21.0 min，95%～5% A；21.1～25.0 min，95% A；检测波长：分段变波长测定，0～21.0 min为254 nm，21.1～25.0 min为210 nm；体积流量 0.8 ml/min；柱温40 ℃；进样量20 μl。

2.2 质谱条件 正离子检测；离子源喷射电压：4.5 kV；毛细管温度：250 ℃；毛细管电压：25 V；鞘气流速：50 arb；辅助气流速：20 arb；碰撞气：氦气；检测方式：多级全扫描质谱。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 分别称取对照品獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸适量，精密称定，加甲醇制成对照品溶液。分别取各对照品溶液适量，制成獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸的混合对照品溶液，质量浓度分别为 36.3、20.2、25.9、21.6、20.7和145.3 μg/ml。

2.3.2 供试品溶液的制备 取藏茵陈粗粉1.0 g，精密称定，置25 ml 具塞三角瓶中，精密加入80%甲醇20 ml，称定重量，超声1.0 h，放冷，用 80%甲醇补足减失的重量，取上清液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考查 精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和20.0 ml，分别置25 ml量瓶中，以甲醇定容，摇匀，即得系列质量浓度的混合溶液，分别吸取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并进行线性回归，得标准曲线方程，见表1。

2.5 LC-UV分析 在上述色谱条件下，采用UV检测方法获得混合对照品，印度獐牙菜提取物的HPLC色谱图见图1。对照品的色谱结果显示獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸的保留时间；根据保留时间，样品的色谱图中1、2、3、4、5和6色谱峰初步鉴别为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸。

2.6 HPLC-ESI-MS/MS分析 在设定的HPLC-ESI(+)-MS/MS条件下，经色谱分离后，得到各离子峰的精确分子质量数，质谱归属结果见表2。基于m/z值，保留时间，进一步鉴定样品的色谱图中1、2、3、4、5和6色谱峰为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸。

2.7 精密度试验 取藏茵陈粗粉，取约1.0 g，精密称取 6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下记录 6 种化合物的峰面积，计算 RSD 值，考查日内精密度。取上述供试品溶液连续 3 d 测定计算 RSD 值，考查日间精密度。结果显示6种成分日内精密度的 RSD 值分别为0.88%、0.97%、0.65%、1.34%、1.12%和1.32%；日间精密度的RSD值分别为 1.37%、1.61%、0.99%、1.51%、1.28%和0.85%，表明该方法精密度良好。

表2 6种成分质谱归属

化合物MS1m/z归属MS2m/z归属獐牙菜苦苷375[M+H]+212[M+H-C6H11O5]+龙胆苦苷357[M+H]+194[M+H-C6H11O5]+芒果苷423[M+H]+260[M+H-C6H10O5]+swertia275[M+H]+260[M+H-CH3]+svinertia289[M+H]+274[M+H-CH3]+齐墩果酸457[M+H]+412[M+H-COOH]+

2.8 加样回收率试验 精密称取已测定的藏茵陈粗粉0.5 g，分别精密加入高、中、低 3 个水平的对照品溶液，每个水平 3 份，共 9 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液。按上述的色谱条件测定 6 个化合物的峰面积，计算回收率及 RSD 值。结果 6 种被测成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齐墩果酸的平均回收率分别为100.1%、99.7%、98.1%、101.7%、100.1%和100.3%，RSD 值分别为1.41%、1.49%、1.69%、1.69%、1.62%和1.64%。测定结果见表 3-8。

2.9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12和24 h 进样分析测定，记录峰面积，考查供试品溶液的稳定性。结果表明所有被测物峰面积的 RSD分别为0.51%、0.55%、0.59%、0.67%、0.70%和0.78%，说明样品稳定性良好。

表4 龙胆苦苷加样回收率试验结果 (n=9)

表5 芒果苷加样回收率试验结果 (n=9)

表6 swertia加样回收率试验结果 (n=9)

表7 svinertia 加样回收率试验结果 (n=9)

表8 齐墩果酸加样回收率试验结果 (n=9)

2.10 重复性试验 取藏茵陈粗粉，取约 1.0 g，精密称取 6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录6 种化合物的峰面积，计算 RSD 值，考查重复性。6 种化合物的 RSD 值分别为0.79%、0.88%、1.74%、1.22%、1.38%和1.66%， 符合规定， 表明本方法重复性良好。

2.11 样品测定 按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，将 6 个待测成分的峰面积代入相应的标准曲线方程中，并计算其质量分数。测定结果见表9。

表9 藏茵陈中 6 种成分的测定结果(n=3)

3 讨论

本实验首次建立了一种快速、准确的 HPLC-MS/MS 分析方法，用于同时测定藏茵陈药材中6种有效成分含量，为藏茵陈药材的质量控制提供了可靠的分析手段。

实验比较了以甲醇、乙醇为提取媒介，提取供试品，结果表明以甲醇提取效率较高。同时考查了提取时间20 min、30 min、1 h和1.5 h，结果显示1 h各成分提取较完全，确定提取时间为1 h。流动相的选择和优化是整个色谱条件的关键，同时考虑到要用质谱进行分析，不挥发性盐类不能使用，如磷酸盐等。为此，我们分别考查了有机相的种类、缓冲盐的种类、缓冲盐浓度、流动相比例等。在确定缓冲盐的种类后，分别考查了2、4和8 mmol/L甲酸铵水溶液为缓冲盐溶液，随着缓冲盐浓度的增加，色谱峰的峰形发生变化，最终确定4 mmol/L为最佳缓冲盐溶液浓度。同时进行了色谱柱的筛选，筛选了C18柱、C8柱、氨基柱、苯基柱、氰基柱各种填料的色谱柱，最终确定使用C18柱。

1 刘莹, 田成旺, 张铁军. 藏茵陈的药理作用与临床应用研究进展[J]. 现代药物与临床, 2010, 25(5): 345-348

2 杨慧玲, 刘建全. 9种“藏茵陈”原植物中的7种有效化学成分研究[J]. 中草药, 2005, 36(8): 1233-1237

3 Shi G F. Isolation and crystal structure of xanthone from Swertia chirayita[J].Chin J StructChem, 2004, 23(10): 1164-1168

4 田成旺, 张铁军. HPLC测定藏茵陈中獐牙菜苦苷和龙胆苦苷[J]. 中草药, 2005, 37(3): 442-443

5 田成旺, 张铁军, 蒋伶活. HPLC 法同时测定藏茵陈胶囊中 7 种有效成分[J]. 中草药, 2013, 44(6): 705-708

6 李爽, 田成旺, 吴帅, 等. 藏茵陈总萜酮的人肠内细菌代谢研究[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(24): 3743-3747

7 孙亚捷, 李向东, 胡芳弟, 等. HPLC 法测定印度獐牙菜中两种黄酮类成分的含量[J]. 兰州大学学报(医学版),2005,31(4): 57-59

8 Shi G F, Lu R H, Yang Y S,etal. 1-Hydroxy-2,3,4,7-tetramethoxyxanthone from Swertia Chirayita [J]. Acta Crystallographica Section E, 2004, 60，878-880

9 Shi G F, Lu R H, Yang Y S,etal. Crystal structure of 1,5,8-trihydroxyl-3-methoxy xanthone from Swertia chirayita [J]. Journal of Chemical Crystallography, 2005, 35(2): 135-139

10 Shi G F, Wang G Y, Chen X F. Screening of radical-scavenging natural neuroprotective antioxidants from Swertia chirayita [J]. Acta Biologica Hungarica, 2013, 64(3): 267-278

2015-11-28

R917

A

1006-5687(2016)01-0008-04