超高效液相色谱-串联质谱法同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂

柯润辉，王丽娟，安红梅，黄新望，尹建军，宋全厚

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100015) 2(国家食品质量监督检验中心，北京，100015)



超高效液相色谱-串联质谱法同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂

柯润辉1,2*，王丽娟1,2，安红梅1,2，黄新望1,2，尹建军1,2，宋全厚1,2

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100015) 2(国家食品质量监督检验中心，北京，100015)

摘要建立了超高效液相色谱-串联质谱仪(ultra performance liguid chromatograph-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜和甜菊糖苷)含量的新方法。样品经超纯水稀释2倍，微孔滤膜过滤后直接进样，用液相色谱-串联质谱(liguid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)进行定量分析。Waters HSS T3色谱柱为分析柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾电离源正负离子切换多反应监测模式检测。结果表明：氨基甲酸乙酯和8种甜味剂在3～500 μg/L的范围内线性关系良好(相关系数r>0.998)，方法检出限在1～3 μg/L，基质加标回收率在89%～106%，相对标准偏差≤9%，完全满足日常检测的要求。该方法前处理简单，测定快速、准确、灵敏度高，非常适合白酒中氨基甲酸乙酯和多种甜味剂的快速筛查和定量分析。

关键词超高效液相色谱-串联质谱仪；白酒；氨基甲酸乙酯；甜味剂

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)是发酵食品在发酵和贮存过程中天然产生的化学污染物[1]。2007年，世界卫生组织的国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物(对人类为很可能致癌物), 认为经食物和饮料酒摄入的EC总量，可能对健康造成潜在危险[2]。甜味剂是一类重要的食品添加剂，用以改善食品口感和风味，其中非糖类甜味剂由于高甜度、低热量、多不参与代谢过程等优点而成为蔗糖的代用品在现代食品工业中普遍应用，但对人工甜味剂的安全性认识和使用限量的规定一直是各国政府和相关机构关注的热点。

虽然我国尚未制定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的限量标准，但白酒中氨基甲酸乙酯问题已经引起行业的关注，成为生产企业日常监控的重点指标。品质优良的白酒由于其复杂特殊的酿造工艺，在发酵过程中就能产生一些醇甜物质(高级醇、多元醇、氨基酸等)，适度的甜味不仅可以遮盖酒类发酵过程中的苦涩等杂味，而且能使酒醇厚，绵软。为了保护我国传统产品，我国食品安全国家标准中明确规定白酒不允许添加任何甜味剂[3]，但个别生产企业为了降低成本，掩盖其产品的口感缺陷，仍违规添加甜味剂。随着我国食品安全监管水平的提升，为提高工作效率，方便监管部门和生产企业对白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的日常监测，开发灵敏度高、适用性广的高通量检测方法具有重要的现实意义。

目前，酒中氨基甲酸乙酯的检测方法主要有气相色谱法[4]、高效液相色谱-荧光检测器法[5]、气相色谱-质谱法[6]、气相色谱-串联质谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[8]等；白酒中甜味剂的检测方法主要有离子色谱法[9]、气相色谱法[10]、液相色谱法[11]、气相色谱-质谱法[12]、液相色谱-串联质谱法[13]等。虽然相关检测方法的报道很多，但经文献检索，目前尚未见到同时测定酒中氨基甲酸乙酯和多种甜味剂的方法报道。由于液相色谱-串联质谱仪的高选择性与高灵敏度，其在食品安全检测中的应用越来越广。本文建立了超高效液相色谱-串联质谱仪同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜、甜菊糖苷8种常见甜味剂的方法，简便、快速、灵敏度高，为大批量的白酒监督抽查和企业日常监控提供及时准确可靠的技术手段，并大大提高工作效率和降低检测成本。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪(ACQUITY TQD), 美国Waters公司；Masslynx 4.1质谱色谱管理软件；超纯水仪，美国Merck Millipore公司；0.22 μm尼龙滤膜，上海安谱科学仪器有限公司。

甲醇、乙腈、乙酸、乙酸铵(HPLC级)，Dikma公司；氨基甲酸乙酯，德国Dr. Ehrenstorfer公司；甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、纽甜、阿力甜，美国Sigma-Aldrich公司和加拿大TRC公司。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制

准确称取氨基甲酸乙酯、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、纽甜和阿力甜标准品，用水溶解并定容(其中氨基甲酸乙酯用甲醇溶解定容)，配制成质量浓度为1 mg/mL的单标储备液。准确移取各标准储备液0.5 mL，混合于100 mL容量瓶中，用流动相稀释配制成5 mg/L的混合标准工作液，然后再逐级稀释成适当质量浓度的系列标准工作溶液。

1.2.2样品溶液的制备

取白酒样品5.0 mL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，超声混匀，过0.22 μm滤膜，滤液供测定。

1.2.3LC条件

使用Waters BEH HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流动相由甲醇和0.1%乙酸水溶液组成，流速0.35 mL/min；梯度洗脱程序为：0 min，甲醇的体积分数为10 %；0～4 min，甲醇的体积分数从10%升至90%，并保持0.5 min；4.5～4.51 min，甲醇的体积分数从90%降至10 %；4.51～6.5 min,甲醇的体积分数保持10%。柱温为40 °C；进样体积：5 μL。

1.2.4MS/MS条件

质谱仪选用电喷雾离子源，根据被测物在正、负离子模式下的灵敏度不同而分类检测，采用多反应监测模式(multi-reactions monitoring，MRM)定量。质谱采用正、负离子模式时，毛细管电压分别为1.0 kV和2.9 kV，脱溶剂气和锥孔气流量分别设为700 L/h和50 L/h，离子源温度和脱溶剂气温度分别为110 ℃和400 ℃。

2结果与讨论

2.1色谱和质谱条件的优化

2.1.1色谱条件的选择

C18填料液相柱在氨基甲酸乙酯和甜味剂检测中应用较多[8,11,13-14]，考虑到流动相缓冲盐pH值为酸性，本研究比较了BEH C18柱和BEH HSS T3柱对氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的分离效果, 发现两款柱子均能较好地分离9种被测物，但在同等条件下，BEH HSS T3柱的分离效果更佳。由于某些被测物极性较强，流动相的洗脱能力不宜过强，同时乙腈的毒性较甲醇大；又由于流动相要进入质谱仪，添加一定量的缓冲盐可以增加响应值；所以考虑甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、甲醇-乙酸水溶液3种流动相体系。以被测物在色谱柱上的分离度、峰形、灵敏度等为考察指标对三种流动相体系进行了比较。结果表明, 从各物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性等指标进行综合衡量，0.1%乙酸-甲醇做为流动相时优于其余两种流动相, 故实验选用0.1%乙酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。

2.1.2质谱条件的选择

采用流动注射直接连续进样方式进行质谱全扫描检测，得到目标分析物一级质谱图，再用氩气轰击该母离子，得到其二级质谱图。结果发现，氨基甲酸乙酯在正离子模式下响应值高于负离子模式，而8种甜味剂均在负离子模式中有较高响应，因此，本研究选择正负离子切换监测的方式，正离子模式监测氨基甲酸乙酯，负离子模式监测甜味剂。除氨基甲酸乙酯、甜蜜素和甜菊糖苷的母离子裂解时只能得到1个明显的碎片子离子外(表1)，其余6种被测物均获得了丰富的碎片离子。利用多反应监测(MRM)模式对各被测物的定性和定量离子对进行质谱参数优化，所得最佳质谱条件参数见表1。在优化的色谱和质谱条件下9种被测物的总离子流(TIC)色谱图见图1。

表1　氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的质谱分析参数

1-氨基甲酸乙酯(1.65min); 2-安赛蜜(1.57 min); 3-糖精钠(1.97 min); 4-甜蜜素(2.57 min); 5-三氯蔗糖(2.79 min);　　　6-阿斯巴甜(2.87 min); 7-阿力甜(3.37 min);　　　　8-纽甜(4.26 min); 9-甜菊糖苷(4.59 min)图1　氨基甲酸乙酯和8种甜味剂(质量浓度为200 μg/L)混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.1　TIC chromatograms of EC and 8 sweeteners standard solution (200 μg/L)

2.1.3样品前处理条件的选择

白酒基质相对较简单，而液相色谱-串联质谱技术在抗基质干扰、灵敏度方面有较强的优势，因此可在LC-MS/MS上直接进样分析。但考虑到白酒含有高比例的乙醇，若直接进样分析，乙醇会影响极性较大的被测物(氨基甲酸乙酯和安赛蜜)在反相C18柱上的保留时间和峰形，导致保留时间偏移，影响检测结果的准确性和重现性。为了消除乙醇对检测的影响，可采用加水稀释、氮吹或旋转蒸发的方法，考虑到氮吹和旋蒸操作相对复杂和耗时，本研究采用加水稀释的方式。稀释的方法可以降低乙醇对色谱峰形影响，减弱基质效应，但是会降低方法的检出限。经过不同稀释倍数样品测试对比，最终确定稀释倍数为2倍。

2.2方法的线性范围和检出限

因白酒的基质效应不明显[14]，本研究采用直接配制的标准溶液工作曲线来考察方法的线性和检出限。将含9种被测物的混合标准储备液用流动相稀释，分别配制成质量浓度为3、10、20、100、500 μg/L的系列混合标准工作液，按上文2.1部分所确定的色谱和质谱条件进行检测，以目标物的峰面积对相应的质量浓度绘制各被测物的标准工作曲线，线性相关系数(r)都在0.998以上。用信噪比为3确定方法的检出限(LOD)，具体参数见表2。

表2　9种被测物的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.3精密度和回收率

准确吸取一定量某白酒样品，用微量移液器准确加入一定量的9种待测物混合标准溶液，配成100 μg/L水平进行回收率实验，按1.2节所述实验步骤进行处理和测定，进行6次重复实验，计算其回收率及相对标准偏差(RSD)。结果表明，白酒中9种待测物的回收率在89%～106%，RSD小于9%(表3)，方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。

表3　白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的添加

注：-为未检出。

2.4实际样品的测定

按所建立的方法对从市场上购买的8个品牌白酒样品(涵盖酱香、浓香、清香、董香、芝麻香和老白干香型)和搜集的2个甜味剂阳性白酒样品进行了检测，每个样品重复测定3次。所检白酒中均检出一定量的EC，部分白酒中检出一定量的安赛蜜、纽甜、糖精钠、甜菊糖苷等(表4)。图2为9号白酒样品氨基甲酸乙酯和有检出甜味剂的质谱图。

表4　市售白酒样品中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的检测结果(n=3)　单位：μg/L

注：-为未检出。

图2　某白酒样品中检出的氨基甲酸乙酯和甜味剂质谱图Fig.2　MRM chromatograms of detected EC and sweeteners in one Chinese distilled spirit sample

3结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱仪同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂含量的方法，前处理简单、分离度好、准确度和灵敏度高。实际样品的检测表明，该方法能够满足白酒中氨基甲酸乙酯和多种痕量甜味剂残留的分析要求，与国标方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本。本方法的建立为监管部门和生产企业对白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的日常监测提供了可靠、准确、高效的技术手段，对提升我国白酒行业安全监管水平具有重要意义。

参考文献

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Simultaneous determination of ethyl carbamate and eight sweeteners in Chinese distilled spirit by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

KE Run-hui1, 2*, WANG Li-juan1, 2, AN Hong-mei1, 2, Huang Xin-wang1, 2,YIN Jian-jun1, 2, SONG Quan-hou1, 2

1(China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, Beijing 100015, China) 2(National Food Quality Supervision and Inspection Center, Beijing 100015, China)

ABSTRACTAn ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometric (UPLC-ESI-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of ethyl carbamate and eight sweeteners in Chinese distilled spirit. The samples were diluted with distilled water, and then filtered through 0.22 μm microporous membrane. The LC separation was performed on a Waters Acquity UPLC system with a HSS T3 column, and 0.1% (v/v) acetic acid/methanol were used as mobile phase for gradient elution. After LC separation, MS/MS was adopted for multiple reaction monitoring mode (MRM). The calibration curves showed good linearity in the range of 3 μg/L to 500 μg/L with the correlation coefficients greater than 0.998. The limits of detection (LODs) were between 1μg/L to 3μg/L. The matrix recoveries were within 89%-106% and the relative standard deviations (RSD) were lower than 9%. The results indicated that the proposed method was easier, faster, more sensitive, and suitable for the qualitative and quantitative confirmation of ethyl carbamate and sweeteners in Chinese distilled spirit.

Key wordsultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS); Chinese distilled spirit; ethyl carbamate; sweeteners

收稿日期：2015-12-08，改回日期：2015-12-28

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604031

第一作者：硕士研究生(柯润辉高级工程师为通讯作者，E-mail: runhuike@163.com)。