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武当地区马尾松松针中原花青素含量测定研究

2016-05-23朱雪松周玉涛郭贤明

安徽医药 2016年4期
关键词:松针高效液相色谱法

李 聪,郑 芳,朱雪松,周玉涛,郭贤明

(1.湖北医药学院附属东风医院药学部,武当特色中药研究湖北省重点实验室;2.湖北医药学院附属第二临床学院;3.湖北医药学院药学院,湖北 十堰 442008)



武当地区马尾松松针中原花青素含量测定研究

李聪1,郑芳1,朱雪松1,周玉涛2,郭贤明3

(1.湖北医药学院附属东风医院药学部,武当特色中药研究湖北省重点实验室;2.湖北医药学院附属第二临床学院;3.湖北医药学院药学院,湖北 十堰442008)

摘要:目的探讨武当地区马尾松松针中原花青素的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定松针中原花青素的含量。色谱柱为Sum Fortis C(18)(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为乙腈∶水(15∶85),流速为0.6 mL·min(-1),柱温30℃,检测波长为280 nm。结果经方法学考察,原花青素在0.258~2.58 g·L(-1)范围内,峰面积与所试浓度线性关系良好,准确度高,精密度好。武当地区松针样品中原花青素含量为44.65 mg·g(-1)。结论该方法操作简便,有效成分原花青素的含量较高,开发前景广阔,旨在其进一步研究提供依据。

关键词:松针;原花青素;高效液相色谱法

松针(Pini Folium)为松科植物华山松(PinusarmandiFranch.)、黄山松(P.TaiwanensisHayata)、马尾松(P.massonianaLamb)、油松(P.tabulaeformisCarr.)等的干燥针叶[1]。《本草纲目》记载:“松叶,温,苦,无毒。主治风湿疮,生毛发、安五脏、守中、不饥延年”,研究表明,松针富含黄酮类、挥发油类、维生素、氨基酸及微量元素等成分,其中黄酮类成分前花青素是目前发现的作用最强的高效抗氧化剂,其抗氧化能力是维生素E的50倍。基于强大的抗氧化和清除自由基能力,药理结果表明松针黄酮具有扩张血管、改善微循环、抗动脉粥样硬化、调节血脂、防衰老等作用[2-4]。

目前,《湖北省中药材质量标准》“松针”项下载入的松属植物有马尾松、油松、云南松,其中对其性状、鉴别、检查(总灰分、酸不溶性灰分)、浸出物等形态组织及一般定量项目有较详细的规范[1],但与药效相关的主要定量指标尚无制订。故本课题拟初步对松针中原花青素的含量进行测定,完善松针质量评价系统,为其进一步开发研究奠定基础。

1仪器与试剂

高效液相色谱仪UltiMate3000(戴安中国有限公司);色谱柱为Sum Fortis C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

松针样品(批号:20141101)采自湖北省赛武当区,经湖北医药学院陈吉炎教授鉴定为松科松属植物马尾松(PinusmassonianaLamb.)。原花青素对照品(北京神州科创生物科技有限公司,批号:MUST-12032802);石油醚(天津化学试剂有限公司);甲醇、乙醇(武汉市中天化工有限责任公司);乙腈、甲醇(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2实验与结果

2.1样品溶液的制备将所得松针粉用石油醚脱脂,过滤,将滤渣放置在阴凉通风处干燥。取样品5.003 g进行超声提取,提取条件:提取液60%的乙醇50 mL,温度为45℃,超声频率为250 W,提取时间为50 min,过滤。精密量取滤液1 mL于5 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得[5-7]。

2.2对照品溶液的制备精密称取原花青素对照品25.8 mg,置于10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成浓度为2.58 g·L-1的溶液,精密量取2.5 mL基本溶液摇匀,置于5 mL的容量瓶中制成1.29 g·L-1的对照品溶液,摇匀,备用。

2.3色谱条件与系统适应性试验色谱柱为Sum Fortis C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为乙腈∶水(15∶85);流速为0.6 mL·min-1;柱温30℃;检测波长为280 nm;进样量为10 μL。在上述色谱条件下分别取“2.2”项下样品溶液与“2.3”项下对照品溶液进样,结果原花青素保留时间约为3.04 min;理论塔板数以原花青素峰计均不低于11 000,原花青素色谱峰的DAD值均不低于999.0,检测原花青素色谱峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5,说明样品的原花青素与相邻的色谱峰分离。

2.4流动相的选择经查阅文献[8-11],调整流动相比例,结果在乙腈∶水(15∶85)时,所得色谱峰良好,分离效果明显,见图1,2。

图1 原花青素对照品的HPLC图

图2 松针提取液的HPLC图

2.5方法学考察

2.5.1标准曲线的制备及线性范围考察分别精密量取“2.2”项下原花青素溶液(2.58 g·L-1)1、2、4、6、8、10 mL,置于10 mL容量瓶中,加甲醇分别稀释至刻度,摇匀,分别作为供试品溶液。分别取各溶液10 μL注入液相色谱仪,记录峰面积,分别为5.659、14.705、31.601、46.914、63.287、76.981,以对照品的峰面积(Y)对原花青素对照品的浓度(X)回归,得回归方程Y=30.8X-1.204,相关系数r=0.999 3,原花青素在0.258~2.58 g·L-1范围内,峰面积与所试浓度线性关系良好。

2.5.2精密度试验取“2.2”项下浓度为1.29 g·L-1原花青素对照品溶液,按照含量测定项下的测定方法,连续进样6次,记录峰面积,分别为39.764、39.121、39.342、39.554、39.592、39.968,计算的RSD值为0.76%,表明仪器精密度良好。

2.5.3重复性试验称取松针粉6份,按照供试品溶液制备方法制备样品溶液,按色谱条件测定,记录峰面积,结果分别为28.246、27.179、27.157、26.992、26.641、27.267,原花青素的平均含量为0.882 g·L-1,RSD值为1.99%。

2.5.4稳定性试验取“2.1”项下松针提取液样品及“2.2”项下原花青素对照品溶液(1.29 g·L-1)分别于0、2、4、6、8、10 h进样,记录原花青素的峰面积,测得对照品溶液中原花青素峰面积的平均值为39.142,RSD值为1.09%,松针提取液样品中原花青素面积的平均值为27.135, RSD值为1.29%,表明对照品和样品溶液在10 h内稳定性均良好。

2.5.5加样回收率试验取松针粉末1 g 共6份,分别按照供试品样品制备方法制备溶液,得到10 mL滤液,取所得滤液0.6 mL于5 mL容量瓶中,加原花青素原液(2.58 g·L-1)1 mL,然后加甲醇稀释至刻度线,摇匀即得。分别取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图,并计算回收率,得平均回收率为97.71%,RSD为2.06%,结果表明此测定方法回收率良好,见表1。

表1 加样回收试验结果

3松针中原花青素含量的测定

按上述的测定方法及测定条件,对松针样品中原花青素的含量进行测定,平均含量为44.65 mg·g-1。

4讨论

4.1波长的选择在200~400 nm波长范围内,由UltiMate 3000二极管阵列检测器得原花青素的最大吸收波长为(279.8±0.2) nm,最终将该研究原花青素的检测波长定为280 nm。

4.2含量测定根据适宜色谱条件,流动相为乙腈∶水(15∶85),流速为0.6 mL·min-1,柱温30℃,波长为280 nm,对马尾松松针样品中原花青素的含量进行测定,平均含量为44.65 mg·g-1,含量较高,加之原花青素具有降血脂、降血糖、抗氧化及增强免疫力等活性,开发利用前景广阔[12-13]。

此外,湖北省松林资源丰富,成本低,生物活性极强的黄酮类成分原花青素的优势资源尚未得到利用,本课题将对不同采收期松叶进行研究,分析采收期对其影响,为确定松针的适宜采收期,制定较完善的质量评价系统等及其制剂的开发应用提供科学依据。

参考文献:

[1]湖北省食品药品监督管理局.湖北省中药材质量标准[M].武汉:湖北科技出版社,2009:77.

[2]刘东彦,石晓峰.药用松针的研究进展[J].中药材,2010,35(10):1701-1705.

[3]孙利民.松针抗衰老作用机制的研究进展[J].中国医药导报,2014,11(2):160-162.

[4]李聪,李鹏,李志浩,等.马尾松松针的研究概况[J].国际中医中药杂志,2013,35(8):748-750.

[5]Kim NY,Jang MK,Lee DG,et al.Comparison of methods for proanthocyanidin extraction from pine (Pinus densifloral) needles and biological activities of the extracts[J].Nutr Res Pract,2010,4(1):16-22.

[6]闫琳娜.松针落叶总黄酮的提取、纯化及抗氧化性能分析[D].长春:吉林大学,2009.

[7]张扬,章建民,马相锋,等.不同采集时间对马尾松针中主要成分的影响[J].中华中医药杂志,2013,28(2):516-519.

[8]刘东彦,胡鹏斌,石晓峰,等.HPLC 同时测定雪松不同部位中4个黄酮类化合物的含量[J].中国现代应用药学,2014,31(12):1510-1514.

[9]曹侃,翁泽斌,颜翠萍,等.皖南地区常见松针2种黄酮类成分的比较研究[J].南京中医药大学学报,2015,31(3):280-282.

[10] 严子军,韦寿莲,汪洪武,等.HPLC法测定松针中原花青素的含量[J].肇庆学院学报,2012,33(5):26-28.

[11] 石晓峰,李师,刘东彦,等.RP-HPLC法同时测定雪松松针中4个有效成分的含量[J].药物分析杂志,2014,34(2):243-246.

[12] 董亦明.松针革命[M].太原:书海出版社,2004:16.

[13] 杨丽华.马尾松松针抗氧化活性研究及其抗氧化功能饮料研制[D].广州:广州医科大学,2014.

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The study on content determination of proanthocyanidins in pine needles in Wudang area

LI Cong,ZHENG Fang,ZHU Xue-song, et al

(DepartmentofPharmacy,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,HubeiKeyLaboratoryofWudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan,Hubei442008)

Abstract:Objective To discuss methods for the content determination of proanthocyandins in pine needles in Wudang area. Methods HPLC-DAD was used to determine proanthocyandin content of pine needles. The Column was Sum Fortis C(18 )(4.6 mm×150 mm, 5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-water (15∶85). The flow rate was 0.6 mL·min(-1). The temperature was 30℃, and the detective wavelength was 280 nm.Results The proanthocyandin of pine needles was well separated with other substances. The proanthocyandin’s peak area had a good linear relationship within the concentration range from 0.258 to 2.58 g·L(-1). The results of methodological study demonstrated that the method met the requirements of the determination. The proanthocyandins contents of pine needles were 44.65 mg·g(-1). Conclusions The method was simple and effective contents of procyanidins were high, thus providing basis for its further study with promising prospects.

Key words:pine needles;proanthocyanidins;HPLC

(收稿日期:2015-11-26,修回日期:2016-02-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.014

通信作者:朱雪松,男,副教授,主任药师,研究方向:医院药学与临床药学,E-mail:dfpharmacy@163.com

基金项目:湖北省十堰市科技局项目(No 14k73);湖北省2011协同创新中心基金(No 2011JH-2014CXTT15)

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