根皮素的微生物转化筛选及消耗率的测定

崔雨，赵艳敏，魏小聪，刘岱琳（1．天津中医药大学，天津300193；．中国人民武装警察部队后勤学院，天津30016）



根皮素的微生物转化筛选及消耗率的测定

崔雨1，2，赵艳敏2，魏小聪2，刘岱琳1，*
（1．天津中医药大学，天津300193；2．中国人民武装警察部队后勤学院，天津300162）

摘要：利用反相高效液相色谱法从24种真菌中筛选出对根皮素具有转化作用的菌种并进行底物消耗率的测定。色谱条件：Welchrom C(18)色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A相：冰醋酸∶水=2∶98（体积比），B相∶乙腈∶水∶冰醋酸= 80∶19.6∶0.4（体积比），梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm。根皮素质量浓度在0.067 1 mg/mL～1.073 6 mg/mL内线性关系良好，回归方程为Y= 3.5×107X + 1.5×106（R2= 0.999 9）。经HPLC检测4种真菌对根皮素有转化作用，当液体培养基中根皮素质量浓度为0.3 mg/mL时，测得培养后底物消耗率分别为60.46 %、43.67 %、91.63 %、40.32 %。该法简便、准确、重现性好，可适用于根皮素微生物转化研究中非单一转化产物的定性和定量分析。

关键词：根皮素；反相-高效液相色谱；微生物转化；底物消耗率

根皮素（Phloretin）化学名为3-（4-羟基苯基）-1-（2，4，6-三羟基苯基）-1-丙酮，主要分布于苹果、梨等水果的果皮及根皮中。现代药理学研究证明，根皮素具有抗肿瘤[1]、抗炎及免疫抑制[2]、降血糖[3]、心血管保护[4]、抗氧化、美白[5]等多种生物活性，广泛应用于保健品、药品、化妆品等行业，受到国内外学者的广泛关注[6-8]。

近年来多采用化学合成的方法[9]对根皮素结构进行修饰，以期获得结构新颖活性更好的根皮素衍生物，但截至目前未达到理想效果。微生物转化是利用微生物细胞或其所含酶系为反应催化剂的生物转化或生物催化技术，现已作为一种最常见的、有效的生物转化体系广泛应用于天然化合物的生物合成；前体化合物的生物转化；药用成分筛选及新药开发、药物代谢研究等诸多领域。

文献调研发现目前利用微生物系统对根皮素进行转化的研究鲜见报道。因此本文首次利用反相高效液相色谱法从24种真菌中筛选出对根皮素具有转化作用的菌种并进行底物消耗率的测定。本研究将为后续利用微生物转化方法对根皮素进行结构修饰提供试验参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

根皮素标准品（纯度为98 %）：天津市科曼思特医药科技发展有限公司；根皮素试药（纯度为90 %）：天津市尖峰天然产物研究开发有限公司；甲醇（分析纯）、乙腈（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；纯净水：中国人民武装警察部队后勤学院自制超纯水；24种菌种：中科院微生物菌种库。

1.2仪器与设备

SW-CJ-2FD双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；HZQ-QX全温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；SB-2000旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FA1204B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；高效液相色谱仪：日本岛津公司；色谱柱Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3方法

1.3.1色谱条件

流动相：A相：冰醋酸∶水=2∶98（体积比），B相：乙腈∶水∶冰醋酸=80∶19.6∶0.4（体积比），梯度洗脱程序见表1。进样体积：10 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm，柱温箱温度：30℃。

表1　HPLC的梯度洗脱程序Table 1 The gradient program of HPLC

1.3.2标准品溶液的配制

精密称取根皮素对照品，加色谱甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，摇匀，制成质量浓度为1.342mg/mL的标准品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.3.3根皮素的微生物转化与分析样品的制备[10]

将保存于固体斜面培养基的24种真菌分别制成104CFU/mL孢子悬液，接种到100 mL液体土豆培养基中，每种真菌设置空白组和给药组，于全温振荡器中培养，培养条件为：转速160 r/min，培养温度28℃。培养48 h后，给药组加入2 mL的根皮素甲醇溶液（质量浓度为15 mg/mL），空白组加入2 mL的甲醇试剂。继续培养72 h，将转化液分别超声20 min，减压抽滤，滤液用等体积的正丁醇萃取3次，萃取液浓缩至干，甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，摇匀，即得到该菌的给药样品溶液和空白样品溶液，待测。

1.3.4对根皮素具有转化作用的菌种筛选[11-12]

按照“1.3.1”项，每种真菌的给药样品溶液和空白样品溶液分别进样10 μL，对比分析每种菌种的给药组、空白组及根皮素标准品图谱，从24种真菌中筛选出对根皮素有转化作用的真菌。

1.3.5对有转化作用的4种真菌进行消耗率的测定

将已保存的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水10 mL，刮菌苔，用无菌4层纱布过滤，用力振荡滤液，制成孢子悬液。经血球计数板对孢子悬液计数，孢子数数量级应控制在104CFU/mL。因此，4种真菌的孢子悬液浓度近似一致，其具有可比性。分别将此浓度的四种真菌孢子悬液1 mL接入到液体土豆培养基中，其后处理同“1.3.3”。

2　结果与分析

2.1根皮素含量测定[13-15]结果

2.1.1系统适用性试验

取“1.3.2”中的对照品溶液进样10 μL，注入液相色谱仪中，按“1.3.1”下色谱条件进行测定，色谱图见图1。

图1　根皮素的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of phloretin

根皮素的保留时间为81.451 min，理论塔板数按根皮素峰面积计算为370 032，拖尾因子1.237。

2.1.2标准曲线的制作

精密量取标准品溶液0.5、1.0、4.0、5.0、8.0 mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。按“1.3.1”色谱条件分别进样10 μL进行测定。以对照品峰面积Y/mAU为纵坐标，对照品质量浓度X/（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得根皮素回归方程为：Y=3.5×107X+ 1.5×106（R2=0.999 9）。结果表明在0.067 1 mg/mL～1.073 6 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3精密度试验

取“1.3.2”项中的根皮素对照品溶液按照“1.3.1”连续进样6次，测得根皮素对照品峰面积及RSD值。RSD值为0.88 %，结果表明仪器精密度良好。

2.1.4稳定性试验

取同一批样品，按“1.3.3”中样品溶液测定方法操作，分别在0、2、4、6、8、10h进行测定，其RSD为1.12%，结果表明样品溶液在10 h内稳定性良好。

2.2根皮素微生物转化结果

2.2.1对根皮素具有转化作用的菌种筛选结果

按照“1.3.1”色谱条件，将各真菌的给药样品溶液与空白样品溶液分别进样10 μL，把每种真菌的给药组、空白组及根皮素标准品图谱进行比对，分析给药组除根皮素峰是否比空白组多出明显的峰。经对比分析，从24种真菌中筛选出4种对根皮素有转化作用的真菌，菌种编号分别为AS 3.2450、AS 3.1858、AS 3.2882、AS 3.510，4种真菌除根皮素峰外比空白都多出了明显的峰。这4种真菌对根皮素的转化测定的HPLC图谱见图2。

图2　4种真菌对根皮素转化的液相图Fig.2 HPLC of biotransformation of phloretin by four kinds of fungi

2.2.2加样回收率试验

取已知含量的转化后供试品，分别精密加入相当于原供试品质量的80 %、100 %、120 %根皮素对照溶液，按“1.3.3”方法制备供试溶液，按“1.3.1”色谱条件分别进样测量峰面积，计算测得量及其回收率，结果见表2。

表2　根皮素的加样回收率Table 1 Results of phloretin recovery

由表2可知，加样回收率分别为101.2 %、103.7 %、103.2 %，平均回收率102.7 %，RSD值为1.30。试验结果表明，加样回收率良好。

2.2.3重现性试验

按照“1.3.1”的色谱条件，分别对有转化作用的菌种AS 3.2450、AS 3.1858、AS 3.2882、AS 3.510的加药样品进行液相分析，每种真菌平行操作6份，测得这4种真菌的剩余根皮素峰面积的RSD值分别为0.72 %、0.86 %、1.29 %、1.68 %，结果表明重现性良好。

2.2.4培养基中根皮素回收率的测定

分别向4组液体土豆培养基中加入2 mL根皮素甲醇溶液（质量浓度为15 mg/mL），按照“1.3.3”样品的制备方法培养，萃取，减压浓缩至干，用色谱甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中。分别取适量用0.45 μm滤膜过滤，进样10 μL，测得根皮素的峰面积，根据标准曲线的回归方程计算出根皮素的含量。根皮素的回收率/%=根皮素质量/加药量×100，结果见表3。

表3　培养基中根皮素的回收率Table 3 The loss of phloretin in medium（n=3）

由表3可知，培养基中根皮素的平均回收率为69.68%。该法能够准确测定培养基中根皮素的回收率。

2.2.5根皮素消耗率的测定

分别取4种真菌的给药组供试液适量，在“1.3.1”色谱条件下进样分析，测得根皮素平均峰面积（n=3），根据回归方程求得剩余的根皮素的质量，算出消耗率。消耗率/%＝（加药量－剩余量/回收率）/加药量×100，结果见表4。

表4　根皮素消耗率结果Table 4 The results of consumption rate

由表4试验结果显示，本试验所筛选出的4种真菌对根皮素有一定的消耗作用，但若要获得该些菌种生物转化根皮素的最优条件，有待于更进一步研究。

3　讨论

1）通过试验确定4种真菌（菌种编号分别为：AS 3.2450、AS 3.1858、AS 3.2882、AS 3.510）对根皮素具有转化作用，并利用HPLC法测定其消耗率，为深入研究其转化产物奠定基础。当液体培养基中底物浓度为0.3 mg/mL时，利用RP-HPLC法测定了4种真菌对根皮素的消耗率分别为60.46 %，43.67 %，91.63 %，40.32 %。试验结果显示不同菌种对根皮素的消耗率存在差异性，其原因可能是菌种自身代谢酶的差异。

2）在微生物转化试验中，菌种的筛选一般选用TLC法，该方法简便但灵敏度低。作者通过HPLC法对根皮素微生物转化进行检测，简便快速、灵敏、准确。

3）对比加药组和空白组的液相图谱，理论上两组图谱除根皮素及转化峰外应该和空白组图谱一致，但是在菌种筛选过程中，有的空白组图谱中的色谱峰比给药组图谱的峰多，其原因可能是加入根皮素对真菌的生长有所影响，所以和空白组有一定的差别。同时，培养基组成、培养条件（温度、摇床转速）、转化时间、底物加入量等对微生物转化的影响也是很大的，这些因素不仅影响消耗率，还可能对转化产物的种类有所影响。在后续研究过程中，本课题组将深入研究根皮素的转化产物及转化条件，以期获得该菌株生物转化根皮素的最优条件。

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Biotransformation Screen of Phloretin and Determination of Consumption Rate

CUI Yu1，2，ZHAO Yan-min2，WEI Xiao-cong2，LIU Dai-lin1，*
（1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2. Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin 300162，China）

Abstract：To study 24 species of fungi on the transformation of phloretin and determine the consumption rate of activated fungi by RP-HPLC. The biotransformation reactions of phloretin were identified by RP-HPLC. The optimum HPLC conditions were as follows：column was Welchrom C(18)（4.6 mm×250 mm，5 μm）. Gradient elution with mobile phase A：HAC∶H2O =2∶98（volume ratio）and mobile phase B：MeCN∶H2O∶HAC=80∶19.6∶0.4 （volume ratio）in the gradient program at a flow rate of 1.0 mL/min was utilized after optimization. The detection wavelength was set at 280 nm. The calibration curve was Y= 3.5×107X + 1.5×106（R2= 0.999 9）with the linear in the range of 0.067 1 mg/mL～1.073 6 mg/mL for phloretin. The results showed that phloretin was biotransformed by four kinds of fungi and the consumption rate were 60.46 %，43.67 %，91.63 %，40.32 % when the concentration of phloretin in medium was 0.3 mg/mL. The results indicated that this detective method was stable and accurate for qualitation and quantitation of the microbial conversation products of phloretin.

Key words：phloretin；RP-HPLC；biotransformation；consumption rate

收稿日期：2015-02-18

*通信作者：刘岱琳（1973—），女（汉），教授，研究方向：天然产物活性成分研究。

作者简介：崔雨（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物活性成分研究。

基金项目：国家自然科学基金项目（31201345）；中国博士后基金项目（2014M562674）；天津市自然科学基金项目（13JCYBJC24400）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.040