槟榔籽乙醇提取物抗氧化性的研究

张璐，郑亚军，李艳，张有林，张润光，张玉峰（.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安7006；.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌57339；3.海南大学园艺园林学院，海南海口5708）



槟榔籽乙醇提取物抗氧化性的研究

张璐2，3，郑亚军1，2，李艳2，张有林1，*，张润光1，张玉峰2
（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；2.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌571339；3.海南大学园艺园林学院，海南海口570228）

摘要：将槟榔籽干燥、粉碎后用75 %乙醇提取，以该提取液为研究对象，分析其对DPPH、羟基自由基、超氧根离子自由基、ABTS自由基的清除能力，并测试其还原力、对二价铁离子的络合能力和对亚油酸自氧化的抑制能力，综合分析其体外抗氧化能力。结果表明，槟榔籽乙醇提取物（AKEE）对DPPH自由基、羟基自由基、超氧根离子自由基的清除能力均强于BHT，均高于常用抗氧化剂BHT。同时，AKEE还表现出较高的还原力，并能有效延缓亚油酸自氧化反应的速率。这表明槟榔籽乙醇提取物具有较好的抗氧化性，在食品或其它工业中有潜在的用途。

关键词：槟榔籽；乙醇提取物；抗氧化；多酚

槟榔（Areca catectu L.），棕榈科热带珍贵植物，为“四大南药”之首，经济价值极高。槟榔全身是宝，其种子、果壳、花、花苞均可入药[1]。研究表明，槟榔果可治腹泻、水肿脚气、小便不利等，同时具有杀虫、抗疲劳、抗肿瘤等多种活性[2-7]。海南省万宁市是我国最重要的槟榔产地，也有多家的槟榔初加工企业。据不完全统计，2010年万宁市槟榔总产量25万t，总产值达10亿元，农民槟榔人均年收入2 292元，占年均收入的39.4 %，槟榔已经成为热带农业的支柱产业[8]。目前槟榔加工中主要利用槟榔的果壳，而对槟榔籽（果仁）的利用率很低。大多数槟榔加工企业直接将槟榔籽丢弃，造成了资源的浪费。

大量的国内外试验证明，人体的许多疾病与体内自由基的失衡密切相关[9-10]。体内的羟基自由基、超氧根离子自由基可进一步引发多种化学反应，生成一系列化学物质，从而使人体自由基失衡，最终导致疾病的产生[11]。同时，羟基自由基等自由基也是导致油脂氧化酸败的重要因素。因而，控制自由基的产生十分关键。目前常用的抗氧化剂多为化学合成，但因安全性问题其使用量和使用范围受到越来越严格的限制。因此，寻找安全、高效、无毒的天然抗氧化剂成为研究的热点。本试验以槟榔籽为原料，研究槟榔籽乙醇提取物的抗氧化性，以期为槟榔籽的开发利用提供理论基础和指导。

1　材料与方法

1.1材料

槟榔籽由海南省万宁市万城镇槟榔初加工基地提供。

1.2试剂及仪器

1.2.1试剂

甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、三氯乙酸、BHT、FeSO4、铁氰化钾、乙醇：天津科密欧公司；DPPH、Ferrozine试剂、没食子酸：Sigma公司；甲醇、冰醋酸等试剂为色谱级；甲苯、二甲苯、苯并芘等试剂均为分析纯。

1.2.2仪器

UV-1200紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；IFFM-E旋转蒸发仪：香港BUCHI公司；PYX-DHG-9101-25A电热恒温鼓风干燥箱：广东韶关科力实验仪器有限公司；JB-3磁力搅拌器：上海智光仪器仪表有限公司。QP2010Plus型GC-MS（气象色谱-质谱联用仪）：岛津（Shimadzu）；D-78532型台式高速冷冻离心机：德国Httch公司。

1.3方法

1.3.1脱脂槟榔籽粉的制备

将槟榔籽切碎后于50℃下在鼓风干燥箱中干燥4 h，粉碎，过20筛。然后在过筛的槟榔籽中按照1∶10的比例加入石油醚，振荡提取2 h后，过滤，收集滤渣，反复脱脂3次。将脱脂后的槟榔籽再次粉碎，过60目筛，得到脱脂槟榔籽粉。

1.3.2槟榔籽粉75 %乙醇提取物的制备

称取槟榔籽粉50 g，加入75 %（体积比）乙醇500 mL，超声波预处理（40 Hz，35℃）10 min后，磁力搅拌提取2 h。过滤，收集滤液。滤渣再次加入75 %乙醇溶液，反复提取3次，合并滤液。将滤液在4℃、4 000 r/min下离心30 min，收集上清液，冷冻真空干燥后得到槟榔籽75 %乙醇提取物（areca kernel ethanol extraction，AKEE）。

1.3.3槟榔籽乙醇提取物抗氧化性的测定

将按照1.2.2制备的AKEE复溶于75 %乙醇中，分别配制成50、100、150、200和250 μg/mL的溶液，用于抗氧化试验。

1.3.3.1 DPPH自由基的清除作用

参照文献[12]的方法：将0.1 mL、不同浓度的AKEE （50 μg/mL～250 μg/mL）加入到1.4 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液中，再用95 %乙醇稀释到3 mL，暗处放置30 min后，517 nm测吸光值，以BHT作对照，每组3个重复，一个空白。

DPPH清除率/% =（1-A样品/A空白）×100

式中：A样品为样品（或对照）管的吸光值；A空白为空白管的吸光值。

1.3.3.2羟基自由基的清除作用

参照文献[13]的方法：在1.34 mL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH7.4）中依次加入28 mmol/L的脱氧核糖溶液0.3 mL，28 mmol/L的双氧水0.3 mL，2.5 mmol/L的三氯化铁溶液30μL，1mmol/L的EDTA-Na20.3mL以及0.1 mL 100 μg/mL的样品溶液。然后添加10 mmol/L抗坏血酸30 μL引发反应，37℃水浴1 h，加入1 %的硫代巴比妥酸溶液0.3 mL，28 %的三氯乙酸30 μL，100℃，水浴20 min，冷却后532 nm下测吸光值。模型管用水代替样品。以BHT作对照。

羟基自由基的清除率/% =（1-A样品/A模型）×100

式中：A样品为样品（或对照）管的吸光值；A模型为模型管的吸光值。

1.3.3.3对超氧根离子的清除能力的测定

参照文献[14]的方法：将AKEE溶解于0.1 mol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液中配成不同浓度（50 μg/mL～ 250 μg/mL）的样品溶液。取该样品溶液0.1 mL，加入到3 mL、3 mmol/L的邻苯三酚溶液中，混合均匀后，在320 nm下比色，每隔30 s记录一次吸光值，共记录10 min。模型管用水代替样品，以BHT做对照。

超氧根离子的清除率/%=（1 - A样品/A模型）×100

式中：A样品为样品管的吸光值；A模型为模型管的吸光值。

1.3.3.4 Fe2+络合能力的测定

参照文献[14]的方法：移取50μL、不同浓度的AKEE （50 μg/mL～250 μg/mL）于试管中，加入1 mmol/L的FeSO4溶液25 μL，5 mmol/L的Ferrozine试剂50 μL，室温反应10 min后，用甲醇定容到3 mL，在562 nm下测吸光值。模型管用甲醇代替样品，用BHT作对照。

Fe2+络合率/% =（1-A样品/A模型）×100

式中：A样品为样品（或对照）管的吸光值；A模型为模型管的吸光值。

1.3.3.5还原能力测定

参照文献[15]的方法：移取200 μL的AKEE （50 μg/mL～250 μg/mL）于试管中，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L，pH6.6），1 mL 1 %的铁氰化钾溶液，混合后于50℃水浴加热20 min，然后加入10 %的三氯乙酸1 mL，4 000 r/min常温离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸馏水以及0.1 %三氯化铁400 μL，混匀后在700 nm测吸光值，用BHT作对照。

1.3.3.6抑制脂质过氧化能力的测定

参照文献[16]的方法，略有改进。取3mL、10 mmol/L亚油酸溶液，加入100 μL AKEE（100 μg/mL），混匀后于37℃下暗反应8 d，空白管不加样品。每天吸取反应液200 μL，加入10 mmol/L硫氰酸铵，300 μL、30 %氯化亚铁，旋涡混合器充分混合，于500 nm测定其吸光值。用BHT作对照。

1.3.4数据处理

抗氧化试验均重复3次，取平均值。采用软件DPS 7.05进行方差分析。

2　结果与分析

2.1AKEE对DPPH·的清除能力

DPPH自由基已被广泛应用于测定植物提取物的抗氧化活性。槟榔籽75 %乙醇提取物（AKEE）在不同浓度下对DPPH·的清除能力见图1。

图1　AKEE对DPPH·的清除能力Fig.1 Scavening activity of AKEE on DPPH radical

如图1所示，与BHT相比，在50 μg/mL～250 μg/mL的浓度范围内，AKEE显示出更强的清除能力。

2.2AKEE对·OH的清除能力

AKEE对·OH的清除能力见图2。

图2　AKEE对·OH的清除能力Fig.2 Scavening ability of AKEE on hydroxyl radical

目前，活性氧诱导的DNA损伤被认为是机体老化的主要原因[8-9，13]。而·OH是已知的活性氧中对生物体毒性最强的一种自由基，它可以通过多种反应破坏生物体的各种大分子，如蛋白质、脂肪和DNA，特别是VB1和鸟嘌呤核苷[16]，对生物体造成很大程度的损伤。是机体内最活跃的自由基之一，它是多种自由基合成的中间产物。如图2所示，随着浓度的增大，AKEE 和BHT对羟基自由基的清除能力也逐渐变大。而在150 μg/mL～250 μg/mL的浓度范围内，AKEE显示出更强的清除能力。

2.3AKEE对超氧根离子自由基（O2-·）的清除能力

AKEE对超氧根离子自由基（O2-·）的清除能力见图3。

图3　AKEE对O2-·的清除能力Fig.3 Scavening ability of AKEE on superoxide radical

O2-·是机体受损或代谢失衡时最先产生的自由基之一，O2-·会引发一系列化学反应，产生更多的自由基。因而O2-·既是机体氧化反应的产物，也是许多氧化反应的引发物和底物。图3的结果表明，AKEE具有一定的清除O2-·能力，且随浓度的提高，其清除出能力也提高。

2.4AKEE的还原力

AKEE的还原力见图4。

图4　AKEE的还原力Fig.4 Reducing power of AKEE

抗氧化剂将铁氰化钾中的三价铁还原为二价铁离子，二价铁离子进一步生成普鲁士兰，其在700 nm处有最大吸收波长。因此在700 nm下的吸光值越高，表明该抗氧化剂的还原力越高，抗氧化性越强[16]。如图4所示，AKEE与BHT表现出相似的还原力；但在50 μg/mL～ 250 μg/mL的范围内，二者的还原力并未随浓度的增大而增强。

2.5AKEE对Fe2+的络合能力

AKEE对Fe2+的络合能力见图5。

图5　AKEE对Fe2+的络合能力Fig.5 Chelating capacity of AKEE on ferrous ion

在生物体内，Fe2+不仅可催化脂质过氧化反应，还能与活性氧反应产生羟基自由基，从而破坏生物体的生物大分子。而生物体的抗氧化剂能够络合二价铁离子而降低其损害。如图5所示，在50μg/mL～250μg/mL的范围内，AKEE对Fe2+的络合能力显著地高于BHT，且随浓度的升高，AKEE的对Fe2+的络合能力相应提高。

2.6 AKEE对亚油酸自氧化的抑制能力

AKEE对亚油酸自氧化的抑制能力见图6。

图6　AKEE对亚油酸自氧化的抑制能力Fig.6 The ihbition ability of AKEE on autoxidant of linoelic acid

脂质过氧化是油脂中多不饱和脂肪酸侧链与活性氧（ROS）氧化反应形成脂质过氧化产物（lipid peroxide，LPO）的过程。脂质过氧化是导致食品腐败变质、丧失食用和商用价值的重要原因之一。图5表明，亚油酸的酸败速度很快，在暗反应3 d后，自氧化的速率呈几何级数增长。而在测试的8 d内，AKEE对亚油酸的自氧化反应的抑制能力与BHT相近，可有效延缓亚油酸变质。

3　结论与讨论

机体新陈代谢所产生的自由基，是代谢过程中的副产物，其过量积累可造成机体损伤。因此，筛选具有清除自由基和脂质过氧化抑制作用的功能因子是目前研究的重点。本实验结果表明，槟榔籽乙醇提取物（AKEE）对DPPH自由基、羟基自由基、超氧根离子自由基具有较强的清除能力；同时表现出较高的还原力，一定的Fe2+络合能力，并能有效延缓亚油酸自氧化反应的速率。这表明槟榔籽乙醇提取物具有较好的抗氧化性。

槟榔籽是目前槟榔加工业中的副产物，价格低廉、来源丰富。因此，槟榔籽乙醇提取物是一种来源丰富、经济、前景良好的的抗氧化剂资源。

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Study on the Antioxidant of Ethanol Extraction from Areca Kernel

ZHANG Lu2，3，ZHENG Ya-jun1，2，LI Yan2，ZHANG You-lin1，*，ZHANG Run-guang1，ZHANG Yu-feng2
（1. College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China；2. Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropic Agriculture Science，Wenchang 571339，Hainan，China；3. College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：The areca kernel was dried，corssed and then extracted by 75 % ethanol aqueous. The antioxidant activity of the extraction from areca kernel by 75 % ethanol（AKEE）was studied through testing its scavenging activity on DPPH radical，hydroxyl radical，ABTS and superoxide radical. Besides，its reducing power，chelating capacity and inhibition of linoleic acid autoxidation were researched，too. Moreover，the polyphone composition of this extraction was also analyzed by RP-HPLC. Compared with BHT，the AKEE exhibited higher scavenging activity on DPPH·，·OH and O2-·，and showed higher reducing power. Results also showed that AKEE could effectively inhibit the autoxidation of linoleic acid. This meant that AKEE was a good nature antioxidant and had potential application in food or other industry.

Key words：areca kernel；ethanol extraction；antioxidant；polyphones

收稿日期：2015-12-18

*通信作者：张有林，教授，博士生导师。

作者简介：张璐（1993—），男（汉），本科在读，研究方向：园艺学。

基金项目：国家科技支撑项目（2012BAD31B03）；海南省重大科技项目（ZDZX2013011）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.001