麻竹叶总黄酮对毛尖茶叶脂氧合酶的抑制性

吴桂玲，吴艳玲，杨再波，刘品祯（.贵州省黔南民族师范学院化学与化工系，贵州都匀558000；.信阳师范学院华锐学院，河南信阳464000）



麻竹叶总黄酮对毛尖茶叶脂氧合酶的抑制性

吴桂玲1，吴艳玲2，杨再波1，刘品祯1
（1.贵州省黔南民族师范学院化学与化工系，贵州都匀558000；2.信阳师范学院华锐学院，河南信阳464000）

摘要：采用正交试验法，以总黄酮含量为考察指标，对麻竹叶的总黄酮提取条件进行优选。结果表明，乙醇体积分数80%、提取时间为2h、料液比为1∶25（g/mL），提取效率较好。最佳工艺条件下黄酮提取率为1.39 %。并且研究了提取出的麻竹叶黄酮化合物对毛尖茶叶脂肪氧合酶LOX的抑制作用，并与人工合成抗氧化剂BHA、BHT和VC的抑制作用进行比较。麻竹叶中黄酮化合物和BHA、BHT及VC对LOX都有抑制作用，IC(50)分别为29.478、10.938、9.049、9.04 μg/mL。麻竹叶中黄酮化合物对毛尖茶叶脂氧合酶有一定的抑制作用。

关键词：麻竹叶；总黄酮；正交试验；毛尖茶叶；脂肪氧合酶；抑制作用

麻竹（Dendrocalamus latiflorus Munro）又名甜竹、大叶乌竹，属禾本科竹亚科牡竹属的大型丛生竹类，广泛分布于中国福建、广东、广西、云南、贵州和四川等亚热带和热带地区。麻竹叶大，宽4 cm～7cm以上，内含有丰富的营养物质，很值得开发利用[1]。竹叶中含有大量的黄酮化合物和其他活性成分，其中黄酮化合物是天然的抗氧化剂[1-2]。竹叶黄酮安全无毒，但是竹叶基本上是作为废弃物，任由其自然落叶、腐烂，尚未充分加以利用，是个相当丰富的潜在资源[3-4]。

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，EC1. 13. 11. 12）属氧化还原酶，通称脂氧酶（LOX），1932年在植物大豆中发现后，后来研究发现在蓝藻细菌、真菌、藻类和很多脊椎动物体中也存在脂氧合酶。它能够选择性催化具有顺，顺-1，4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的加氧反应，生成具有共轭双键的多不饱和脂肪酸氢过氧化物[5-6]，通过对其分子加氧，形成过氧化氢衍生物，是非常重要的药物合成和化学合成的中间体。

茶树叶片中LOX位于叶绿体的片层结构中，茶叶的加工过程是塑造茶叶优良品质的关键，在此过程中，鲜叶中的多种酶类作用于鲜叶内含物，LOX在绿茶加工过程中主要作用于鲜叶摊放过程和杀青初期对绿茶的香气、滋味、汤色、外形等品质均可产生重要的影响[7]，但是也应该注意防止其较大量残留引起的干茶变质。茶叶中的脂肪氧合酶是茶叶产生陈味的主要原因[8]，因此，了解LOX的特性有助于在加工储藏中尽可能的抑制其活性而达到有效保藏的目的。已有报道用电化学方法研究了槲皮素、紫杉叶素等4种黄酮化合物对大豆脂肪氧合酶的抑制作用[9]，而麻竹叶黄酮类化合物对茶叶中的脂肪氧合酶的抑制作用还鲜见报道。本研究对麻竹叶中黄酮类化合物的提取工艺进行研究，旨在为天然黄酮类物质的提取条件的优化提供有益的参数，并且探讨了麻竹叶中黄酮类化合物对都匀毛尖茶叶中的脂肪氧合酶的抑制作用，并与人工合成油脂抗氧化剂BHA和BHT以及抗坏血酸对毛尖茶叶脂肪氧合酶活性的抑制作用进行比较，初步探讨天然黄酮类化合物对脂氧合酶活性的抑制作用。有助于为进一步进行其失活机理的研究提供参考和方向，为茶叶保鲜的研究奠定了一定的基础。

1　材料与方法

1.1原料、试剂与仪器

麻竹叶，2014年采自都匀市，以水洗净，烘干，粉碎20目过筛；芸香叶苷，含量≥95.0 %；茶树鲜叶采自都匀牛场；亚油酸（Sigma生产，纯度为99. 9 %）；吐温20；麦氏缓冲溶液（pH=6.3，0.1 mol/L，柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液）；叔丁基茴香醚（BHA）；2，6 -二叔丁基-4 -甲基苯酚（BHT）；抗坏血酸（VC），其他化学试剂均为分析纯，试验用水为黔南民族师范学院化学系分析化学实验室自制去离子水。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；CL-2型恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-2C精密pH计：上海理达仪器厂；HH-S型数显恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；GTR21-1高速冷冻离心机：上海赵迪生物科技有限公司；RE-2000Z旋转蒸发仪：郑州英三谷华仪器有限公司；高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；101型电热鼓风干燥箱；南通市通州区锐锋制药机械有限公司。

1.2方法

1.2.1麻竹叶总黄酮化合物的提取

称取一定量的麻竹叶，加入一定体积的石油醚，在64℃左右回流，每次1 h，共3次。抽滤，弃滤液，留滤渣。加入一定浓度和一定体积的乙醇，在80℃下，回流一定时间，共回流1次。再抽滤，留滤液，弃滤渣。将滤液旋转蒸发。加入无水乙醇或无水甲醇溶解，定容成体积为V2，备用。

1.2.2芦丁标准曲线的制作建立

将芦丁标准样品置于105℃下干燥至恒重，准确称取0.020 0 g样品，用少量无水甲醇溶解，再用无水乙醇定容至100 mL，得到0.20 mg/ mL的标准溶液。

准确吸取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL，分别置于7支25 mL的容量瓶中，加入5 %的亚硝酸钠溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min；加入5 %的硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀后，放置5 min；加入4 %的氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，用无水乙醇溶液定容，放置15 min至20 min，于紫外可见分光光度计下进行光谱扫描，找出500 nm处芦丁标准液的吸光度A，试剂空白参比，以吸光度为纵坐标，芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。

1.2.3麻竹叶中总黄酮含量测定

测定麻竹叶中黄酮类化合物的含量，利用紫外可见分光光度计，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法[10]，在波长为500 nm处测定吸光度。取一定体积麻竹叶黄酮溶液于25 mL容量瓶中，加入5 %的亚硝酸钠溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min；加入5 %的硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀后，放置5 min；加入4 %的氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，用无水乙醇溶液定容，放置15 min至20 min，于紫外可见分光光度计下进行光谱扫描，找出500 nm处的吸光度A。根据芦丁标准曲线，计算出黄酮样品的浓度，再代入下式计算总黄酮的含量和提取率。

式中：C为样品中总黄酮浓度，mg/mL；V1为1.2.3节中取出测量的体积，mL；V2为1.2.1节中定容的体积，mL；m为称取麻竹叶的质量，g。

1.2.4乙醇提取工艺因素水平的确定

通过参考文献，以麻竹叶作为原料，选择乙醇浓度、提取时间、固液比3个因素，每个因素选3个水平，按照L9（34）正交进行试验。乙醇浓度选取60 %、80 %、95 % 3个水平，时间选取1、2、2.5 h 3个水平，固液比选取1∶10、1∶20、1∶25（g/mL）3个水平。其提取工艺试验水平设计见表1。

表1　乙醇提取正交试验因素水平表Table 1 The different levels of the factors in orthogonal test

1.2.5毛尖茶叶脂肪氧合酶（LOX）的提取

将茶鲜叶洗净晾干，粉碎，称取10.000 0 g，加入200 mL pH为6.3的麦氏缓冲溶液，匀浆2 min，过滤，滤液在4℃时高速离心5 min，取上清液，加入固体硫酸铵至30 %饱和度，放置冰箱4 h后高速离心5 min，再取上清液，加入固体硫酸铵至70 %饱和度，在冰箱中过夜，取出高速离心10 min，取沉淀加入15 mL麦氏缓冲溶液溶解，得到粗酶液[11]。

1.2.6茶叶脂肪氧合酶（LOX）活性测定

茶叶脂氧合酶（LOX）的酶活性采用分光光度法进行测定。以50℃，pH 6.3下，亚油酸为底物的15 mL反应体系在234 nm处每分钟增加0.001吸光度值定义为一个酶活单位[12-13]。

底物的制备：参照Axelrod等的方法[14]，略作修改，具体操作如下，将0.25 mL Tween 20分散于10 mL pH 9.0的0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入0.27 mL亚油酸，充分混合，加入1 mol/L氢氧化钠溶液使体系澄清，调pH至9.0，然后用上述缓冲液稀释到500 mL作为底物。

参照Axelrod等的方法[14]，略作修改，具体操作如下：3 mL反应体系中含亚油酸钠母液50 μL，缓冲液2 750 μL，粗酶液0.2 mL。在50℃下反应，于234 nm处测定消光值。2 min时记录一个数据，到4 min时再记录一个数据，观察OD值的变化，酶活性以△OD234·g-1FW·min-1来表示，重复3次。

LOX计算公式：A =1 000×[OD4min-OD2min]/2

式中：A为酶活性单位；OD4min为反应4 min的OD值；OD2min为反应2 min的OD值。

1.2.7茶叶脂肪氧合酶（LOX）的活性抑制性测定

分别取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL一定浓度的麻竹叶黄酮化合物加入到含0.2 mL酶液（已稀释一定倍数），50 μL底物的3 mL反应体系中，混匀后用pH 为6.3的缓冲溶液补足至3 mL，于50℃恒温水浴中恒温2 min，进行光谱扫描，并记录234 nm处的吸光度，再于50℃恒温水浴中恒温2 min，进行光谱扫描，并记录234 nm处的吸光度。黄酮化合物对脂肪氧合酶的抑制率按下式计算：抑制率/% = [（A0- A1）/A0]×100

式中：A0为无抑制剂时的酶活力；A1为加抑制剂时的酶活力。

1.2.8人工合成抗氧化剂BHA和BHT以及VC对茶叶LOX活性抑制性测定

分别取一定浓度和一定体积的BHA和BHT以及VC化合物加入到含0.2 mL酶液（已稀释一定倍数），50 μL底物的3 mL反应体系中，混匀后用pH为6.3的麦氏缓冲溶液补足至3 mL，于50℃恒温水浴中恒温2 min，进行光谱扫描，并记录234 nm处的吸光度，再于50℃恒温水浴中恒温2 min，进行光谱扫描，并记录234 nm处的吸光度。

2　结果与分析

2.1芦丁校准曲线绘制和样品总黄酮含量的测定

以500 nm下测定的芦丁标准品溶液的吸光度值与浓度的关系，作线性回归，可得芦丁标准品溶液浓度C与吸光度A间的回归方程为y = 10.874 12X + 0.008 6。相关系数R2= 0. 999 5，结果见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1 Standard curves of rutin

将500 nm处麻竹叶黄酮样品溶液的吸光度值代入上面的回归方程得到样品麻竹叶中总黄酮含量。

2.2乙醇提取黄酮工艺参数确定

利用乙醇提取麻竹叶总黄酮，对影响提取率的乙醇浓度、提取时间和固液比等因素进行了正交试验，结果见表2。

表2　乙醇提取麻竹叶黄酮正交试验结果Table 2 The results of the orthogonal test for extracting flavonoids by ethanol

续表2乙醇提取麻竹叶黄酮正交试验结果Continue table 2 The results of the orthogonal test for extracting flavonoids by ethanol

由表2可知，各因素对提取效果影响的主次顺序为：乙醇浓度（A）>提取时间（B）>固液比（C）。根据试验结果与分析，最佳条件为A2B2C3，即乙醇浓度为80 %，提取时间为2 h，固液比为1∶25 g/mL。最佳条件下提取的总黄酮测得的含量为13.9 mg/g，总黄酮提取率为1.39 %。

2.3茶叶脂肪氧合酶（LOX）活性测定

根据酶活力计算公式，在50℃，pH 6.3条件下，试验测得茶叶脂氧合酶的酶活力A = 33.9。

2.4麻竹叶黄酮对茶叶脂肪氧合酶（LOX）的活性抑制作用

在温度为50℃，pH为6.3条件下，随着麻竹叶黄酮化合物浓度的增大，黄酮化合物对茶叶脂肪氧合酶催化亚油酸底物的抑制性也随之增强，结果见图2。

图2　麻竹叶黄酮对LOX的抑制率Fig.2 The inhibition rate for LOX of flavonoids from dendrocalamus latifloru

麻竹叶黄酮：IC50= 29.478 mg/mL。

2.5BHA、BHT以及VC化合物对LOX的抑制作用

在温度为50℃，pH为6.3，浓度相同条件下，BHA、BHT和VC均对茶叶脂肪氧合酶催化亚油酸底物有抑制性，且抑制率随着浓度的增加而增强。结果见图3。

图3　BHA和BHT以及VC对LOX的抑制率Fig.3 The inhibition rate for LOX of BHA、BHT and VC

计算得BHA：IC50= 10.938 mg/mL，BHT：IC50= 9.049 mg/mL，VC：IC50= 9.04 mg/mL。

2.6讨论

相同条件下，不同黄酮化合物对大豆脂肪氧合酶抑制性（IC50）与人工合成抗氧化剂叔丁基茴香醚（BHA）、2，6 -二叔丁基- 4 -甲基苯酚（BHT）的抑制作用都不相同，其主要原因可能是因为不同抗氧化剂的结构不同[15-16]。

3　结论

本试验采用正交试验优化了麻竹叶总黄酮乙醇提取工艺，得到影响因素主次顺序为乙醇浓度>提取时间>料液比。在最佳提取工艺条件，80 %乙醇，提取时间2 h，固液比1∶25 g/mL下，提取率可达1.39 %。麻竹叶中黄酮化合物对毛尖茶叶脂氧合酶有一定的抑制作用，在温度为50℃，pH为6.3条件下，随着黄酮化合物和人工合成抑制剂浓度的增大，天然黄酮化合物和人工合成抗氧化剂均对茶叶脂肪氧合酶催化亚油酸底物的抑制性也逐渐增强，相比较而言，人工合成抗氧化剂的抑制效果比麻竹叶中黄酮化合物的抑制性强，通过此研究，有助于为进一步研究如何控制在干茶中保留的LOX在贮藏中作用于脂肪酸产生低碳醛而使茶叶产生异味，为茶叶保鲜的研究奠定了一定的基础。

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Inhibitory Effects of Flavonoids in Leaves of Dendrocalam Latiflorus on the Activity of Lipoxygenase from Maojian Tea Leaves

WU Gui-ling1，WU Yan-ling2，YANG Zai-bo1，LIU Pin-zhen1
（1. Department of Chemistry and Chemical Engineering，Qiannan Normal College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China；2. Huarui College，Xinyang Normal University，Xinyang 464000，Henan，China）

Abstract：The optimizing extraction condition on the basis of flavonoids were determined by orthogonal design. The results showed that the optimal conditions were as follows：80 %（volume fraction）ethanol，extraction time at 2 h，1∶25（g/mL）solid-liquid ratio，the yield of total flavonoids on the optimal conditions was 1.39 %. The inhibitory effects of flavonoids from leaves of dendrocalam latiflorus on the activity of lipoxygenase from Maojian tea leaves were also studied. And compared with same concentration of BHA，BHT and VC. Flavonoids from leaves of dendrocalam latiflorus，BHA，BHT and Vc all have inhibitory effects on the activity of lipoxygenase from Maojian tea leaves，IC(50)were 29.478，10.938，9.049，9.04 μg/mL.The flavonoids from leaves of dendrocalam latiflorus had certain inhibition on lipoxygenase from Maojian tea leaves.

Key words：dendrocalamus latifloru；flavonoids of bamboo leaves；orthogonal design；Maojian tea leaves；lipoxygenase；inhibitory effects

收稿日期：2015-03-25

作者简介：吴桂玲（1985—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物研究。

基金项目：2013年度贵州省科学技术厅、黔南州科学技术和知识产权局、黔南民族师范学院联合基金计划项目（黔科合J字LKS[2013] 17号）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.007