甜叶菊苷类提取工艺研究

何巧丽，李柯翱，季志红，田树革(新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐　800;新疆奇康哈博维药有限公司，乌鲁木齐　8006;新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐　800)



甜叶菊苷类提取工艺研究

何巧丽1，李柯翱2，季志红2，田树革3
(1新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐830011;2新疆奇康哈博维药有限公司，乌鲁木齐830026;3新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐830011)

摘要:目的优化甜叶菊苷类的提取工艺条件。方法通过考察料液比、提取温度、提取时间和提取次数对甜叶菊中甜菊苷(Stevioside，St)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)含量的影响，设计正交试验，以RA含量为评价指标，优选出甜叶菊回流提取的最佳提取工艺。结果最佳条件:料液比(m/v)为l g∶20 mL、提取温度为80℃、提取时间为1 h、提取次数为2次。结论经过重复性实验验证，该提取工艺稳定可行。

关键词:甜叶菊;正交试验;甜菊苷;莱鲍迪苷A

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)，又称甜菊、甜茶，是菊科甜叶菊属植物［1］。为多年生草本植物，其叶含30多种甜菊糖苷类化学成分［2－3］，甜叶菊原产于南美巴拉圭和巴西交界的高山草地，我国于1976年引种，它是一种新的甜味剂植物［4－5］。甜菊糖，提取自甜叶菊的叶片，是一系列甜菊糖苷类的混合物，其中RA(莱鲍迪苷A，Rebaudioside A)和St(甜菊苷，Stevioside)为甜菊糖中2种主要组分［6－7］。作为一种天然甜味剂，由于甜叶菊中RA具有高甜度、低热量、安全无毒等特点，长期食用不会使人发胖。故可作为肥胖症、低血糖、高血压、心脏病等患者的非热性甜味剂，也可把它用于糖尿病患者的辅助治疗药物。甜叶菊有强壮身体和调节胃酸等作用，被称为“健康长寿”之药［8－10］。甜叶菊糖苷传统提取方法为热水浸提法，该方法耗时长、能耗高，增加了后续分离纯化的难度。本研究采用回流提取法，以甜叶菊中的RA含量为指标进行评价，利用正交试验优化筛选最优化提取工艺，为甜叶菊后续开发利用提供参考价值。

1　材料与方法

1．1仪器与试剂AK-100摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)，METTLER TOLEDO型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，KQ-200KDE型超声清洗器(昆山市超生仪器有限公司)，HH-S6水浴锅(金坛市医疗仪器厂)，TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，Agilent-1220LC-高效液相色谱仪、DAD检测器、二元泵(美国Agilent公司)。甜菊苷对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号:MUST-14102111)、莱鲍迪苷A对照品(曲阜香洲甜菊制品有限责任公司，批号:20150203)，乙醇、磷酸钠等均为分析纯(沈阳化学试剂厂)，乙腈为色谱纯试剂(Fisher)，实验用水为自制蒸馏水。

1．2实验药材甜叶菊于2013年9月在新疆阜康市采集，经新疆医科大学中医学院生药学教研室徐海燕副教授鉴定为菊科多年生草本植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的干燥叶片。

1．3实验方法

1．3．1原材料的实验预处理取甜叶菊叶，干燥后用粉碎机粉碎，过3号筛，备用。

1．3．2 St和RA的提取方法称取甜叶菊粉末加入一定量的70%乙醇，浸泡30 min，回流提取一定时间后，将提取液离心，收集上清液，浓缩，蒸干，用流动相［乙腈-磷酸钠缓冲液(32∶68，pH=2．60)］定容至50 mL，进行HPLC分析，测定提取液中St和RA的含量。

1．3．3甜菊苷和莱鲍迪苷A含量测定方法

1．3．3．1色谱条件Agilent·Zorbax·SB-C18色谱柱(4．6mm×250 mm，5μm)，流动相:乙腈-磷酸钠缓冲液(32∶68，pH=2．60)，流速1 mL/min，柱温40℃，检测波长210 nm。在此色谱条件下的理论塔板数为2 000，分离因子为1．52，分离效果较好，见图1。

1．3．3．2对照品溶液制备分别称取干燥至恒重的St和RA对照品适量，加入流动相溶解，制成浓度分别为0．426 mg/mL和0．908 mg/mL的对照品溶液，备用。

1．3．3．3对照品溶液标准曲线的制备和线性关系的考察将“1．3．3．2”项下试验方法制备的对照品溶液在“1．3．3．1”项下色谱条件测定，进样量分别为1、2、3、4、5μL和2、3、4、5、6μL，以对照品的含量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程分别为:Y=105．7X－6．312(r=0．999 9)和Y=179．4X－14．55(r=0．999 9)，St对照品溶液含量在0．426～2． 130μg间线性关系良好，RA对照品溶液含量在1．816 ～5．448μg间线性范围关系良好。

图1　St和RA的液相色谱图(A:RA，B:St)

1．3．3．4精密度试验分别精密吸取“1．3．3．2”项下对照品溶液各10μL，按“1．3．3．1”项下色谱条件进样，分别测定St和RA峰面积，计算St和RA的峰面RSD(n=6)分别为1．19%和0．58%，表明进样方法和仪器精密度良好。

1．3．3．5重复性试验精密称取甜叶菊样品1．0 g，按“1．3．2”项下方法制备甜叶菊样品溶液，分别精密吸取10μL，按“1．3．3．1”项下色谱条件进样分析，依据峰面积积分值采用标准曲线计算St和RA含量，2组分含量的RSD(n=6)分别为0．33%和0．21%，表明样品制备方法重复性良好。

1．3．3．6加样回收率试验精密称定已知St和RA含量的甜叶菊佯品粉末约0．5 g，平行称定6份，每份按高、中、低3种浓度分别加入St和RA对照品适量，按“1．3．2”项下方法制备甜叶菊样品溶液，按“1．3．3．1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，采用标准曲线计算含量，求取待测组分的平均回收率。St和RA平均回收率分别为(99．54±0．48)%和(99．92±0．30)%，RSD(n=6)分别为0．480%和0．304%。

1．3．4单因素试验

1．3．4．1料液比考察精密称取预处理后的甜叶菊粉末2 g，分别加入(1:14、1:16、1:18、1:20、1:22倍量的70%乙醇)，在温度为80℃条件下回流1 h，由试验结果探讨不同料液比对St和RA含量的影响。

1．3．4．2提取时间考察精密称取预处理后的甜叶菊粉末2 g，加入20倍量70%乙醇，在温度为80℃条件下分别回流0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 h，由试验结果探讨不同提取时间对St和RA含量的影响。

1．3．4．3提取次数考察精密称取预处理后的甜叶菊粉末2 g，加入20倍量70%乙醇，在温度为80℃条件下分别回流提取1、2、3、4次，由试验结果探讨不同提取次数对St和RA含量的影响。

1．3．5正交试验优选在单因素试验基础上，主要以甜叶菊粉末中RA的含量为指标，选取料液比、提取时间、提取次数为考察因素，采用正交试验优化甜叶菊药材中甜菊苷及莱鲍迪苷A的提取工艺条件，因素水平表，见表1。

表1　因素水平表

2　结果

2．1单因素试验

2．1．1料液比对St和RA含量的影响在保持温度、提取时间、提取次数一定的情况下，由于料液比的增加，含量也随之逐渐升高后慢慢趋于平稳。在料液比较低时，含量较低，当料液比＞1:20时，RA含量达到最高基本不再增加，表明甜叶菊粉末中的RA已基本提取完全，故选取料液比为1:20作为正交试验指标之一，见图2。

图2　料液比对甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的影响

2．1．2提取时间对St和RA含量的影响在保持温度、料液比、提取次数一定的情况下，由于提取时间的增加，含量也随之逐渐升高，逐渐趋于平稳状态。由图可知，在提取时间较短时，含量较低，当提取时间大于1 h时，由于RA含量达到最高基本不再增加，表明甜叶菊粉末中的RA已基本提取完全，故选取提取时间1 h作为正交试验指标之一，见图3。

图3　提取时间对甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的影响

2．1．3提取次数对St和RA含量的影响在保持温度、料液比、提取时间一定的情况下，由于提取次数的增加，含量也随之逐渐升高后逐渐趋于平稳状态。由图可知，在提取次数较少时，含量较低，当提取次数大于2时，RA含量达到最高基本不再增加，表明甜叶菊粉末中的RA已基本提取完全，故选取提取次数2次作为正交试验指标之一，见图4。

图4　提取次数对甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的影响

2．2正交试验各因素对St和RA含量的影响大小顺序对于St和RA均是C(提取次数)＞A(料液比)＞B(提取时间);每个因素3个水平之间的趋势分别为A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，直观分析最佳提取工艺条件为A2B2C2，即提取时间为1 h，提取次数2次，料液比1∶20。方差分析结果表明:提取次数C在试验中为显著性影响因素，对提取物中甜菊苷含量影响最大，而B、C差异对St和RA的提取含量无统计学意义，提取次数C在试验中为显著性影响因素，对提取物中甜菊苷和莱鲍迪苷A含量影响最大，而B、C因素对其影响较小，结果见表2～5。

表2　正交试验结果表

表3　正交设计试验结果及分析结果

2．3验证试验以所得最佳工艺条件提取3批样品，测定样品提取液中St和RA含量分别为6．08%、5．98%、6．02%和11．12%、11．16%、11．08%，平均值分别为6．03%和11．12%，与预测值接近，表明优选的提取条件稳定可行。

表4　甜菊苷方差分析表

表5　莱鲍迪苷A方差分析表

3　讨论

本研究以提取时间、提取次数、溶剂用量等为影响因素，通过对正交试验结果进行方差分析，确定了甜叶菊中甜菊苷St和RA的最优化提取工艺。从方差分析结果可直观分析出提取次数在试验中为最显著性影响因素。从正交试验结果确定了各因素最佳的水平组合为A2B2C2，经重复性实验验证此工艺条件稳定可行，优化提取工艺方案科学合理。

乙醇提取法以其无毒、溶媒极性可调、操作简便、提取效率高、环境污染小、适合大规模工业生产等诸多优点而被广泛应用于植物化学组分的分离提取。由于RA和St化学结构的差异使其具有不同的水溶性，RA分子结构上具有3个葡萄糖基团，其亲水性较St强，为了兼顾其极性和提高其提取率，本实验在提取过程中选用70%的乙醇作为提取溶剂，RA和St得率在纯水和纯乙醇的情况下远低于使用混合溶媒的情况。目前，国内对甜菊苷的工艺控制的研究尚属空白，本研究可为今后甜菊苷的提取提供参考依据。

参考文献:

［1］黄应森，陆荣刚．甜菊栽培技术［M］．南京:江苏科学技术出版社，1981，52．

［2］Ohta M，Sasa S，Inoue A，et al．Acterization of novel steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana Morita［J］．JAppl Glycosci，2010，57(3):199-209．

［3］Chaturvedula VS，Clos JF，Rhea J，etal．Minor diterpenoids glycosides from the leaves of Stevia rebaudiana Morita［J］．Phytoehem Lett，2011，4(3):209-212．

［4］舒世珍．新糖料作物-甜叶菊在京试种成功［J］．农业科技通讯，2012，41(2):19-20．

［5］舒世珍．甜菊引种三十年［J］．中国种业，2010，28(6):21-23．

［6］何毓娟，黄彩云，李淑萍．甜叶菊的育种目标及品种选育［J］．种子世界，1997，15(9):36-37．

［7］杨文婷，蔡乾蓉，徐应文，等．四川引种甜叶菊的糖苷含量变异及优良单株筛选［J］．中国糖料，2010，32(2):27-30，34．

［8］陈天红，张杨，刘晓航，等．新型台吡啶基辩躇对甜菊锋中莱鲍迪甙A的富集与分离［J］．中国科学B辑．1999，29(8):461-466．

［9］曹芳，陈金秀，邓先扩，等．甜菊苷镇痛作用初探［J］．中外健康文摘医药月刊，2008，5(8):61-62．

［10］马磊，石岩．甜叶菊的综合开发利用［J］．中国糖料．2009，31(1): 68-72．

［11］秦冬梅，买尔旦·马合木提·古丽先·胡加，正交试验优化复方紫草制剂醇沉工艺［J］．新疆医科大学学报，2007，30(5): 464-466．

(本文编辑施洋)

·临床医学研究·

Study on extraction process of Stevia rebaudiana Bertoni by orthogonal design

HE Qiaoli1，LIKeao2，JI Zhihong2，TIAN Shuge3
(1College of TCM，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China;2Xinjiang Qi Kang Ha Bo Medicial Company，Urumqi，830026，China;3Central Laboratory of Xinjiang Medical University，Urumqi，830011，China)

Abstract:Objective To optimize the extraction process of Rebaudioside A and Stevioside in Stevia rebaudiana Bertoniextracts by single-factor experimental conditions and orthogonal designmethod．Methods By investigating solidliquid ratio，extraction temperature，extraction time and effects of extraction times on the contents of sweet leaf chrysanthemum stevioside(St)and rebaudioside A(rebaudioside A，RA)，design orthogonal test，put RA content as evaluation indexes to optimize a extraction procedure of Stevia rebaudiana reflux extraction．Results The best conditions:solid-liquid ratio(m/v)was 1 g∶20 mL，extraction temperature was 80℃，extraction time was 1 h，extraction timeswas2 times．Conclusion The extraction process is stable and feasible，and the extraction efficient is high．

Keywords:Stevia rebaudiana Bertoni;Orthogonal test;Stevioside;Rebaudioside A

［收稿日期:2015-11-5］

通信作者:田树革，博士，教授，博士生导师，研究方向:中药质量控制及评价，E-mail:tsgyz@sina．com。

作者简介:何巧丽(1990－)，女，在读硕士，研究方向:中药化学。

基金项目:新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2013911135)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．016

中图分类号:R94

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0327-04