反复分批式反应提高磷脂酰丝氨酸的生产能力

封娟娟，朱南南，邓杨敏，韩晓玲，张小里，赵彬侠（西北大学化工学院，陕西 西安 70069；西安力邦制药有限公司，陕西 西安 70075）



反复分批式反应提高磷脂酰丝氨酸的生产能力

封娟娟1，朱南南1，邓杨敏1，韩晓玲2，张小里1，赵彬侠1
（1西北大学化工学院，陕西 西安 710069；2西安力邦制药有限公司，陕西 西安 710075）

摘要：磷脂酶D（PLD）催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸（PS）反应是在油-水两相体系中进行的，大豆磷脂（PC）溶于有机相中，L-丝氨酸溶于水相中，但反应过程中产生副产物——胆碱，抑制酶的催化反应速率，需及时移除胆碱。本文主要采用反复分批式反应来解决这一问题。并考察了增大底物PC的浓度，PS的收率大大降低。低底物PC浓度下，添加不同浓度胆碱，转酯速率及PS收率都降低；高底物PC浓度下，采用反复分批式反应去除胆碱，转酯反应速率提高38％，PS收率达67％。研究表明反复分批式操作是一种生产磷脂的新型工艺，其中PS的生产能力明显提高，而且重复10次反应后，固定化酶活力仍保持58％，纳米SiO2固定化磷脂酶D较好地适用于反复分批式反应。

关键词：磷脂酰丝氨酸；固定化磷脂酶D ；反复分批式反应 ；胆碱

第一作者：封娟娟（1989—），女，硕士研究生。E-mail juan026juan@163. com。联系人：张小里，教授，博士生导师，研究方向为生物催化过程、催化反应工程。E-mail xlzhang@nwu.edu.cn。

磷脂酰丝氨酸（phosphatidyiserine，简称PS)是一种稀有磷脂，虽然在人体内数量极其稀少但功能显著，具有提高大脑机能、集中注意力、改善记忆力、缓解压力、促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪、修复大脑损伤等功效[1]。它可影响脑信息的传递，并帮助大脑记忆的储存和读取，被誉为继胆碱和“脑黄金”DHA之后的一大新兴的“智能营养素”。

磷脂酰丝氨酸的主要制备途径有提取法[2]和酶转化法，研究发现，PS与磷脂酰胆碱（PC）以及磷脂酰乙醇胺（PE）等甘油磷脂产品可互相转化，使得提取工艺复杂、费力。而且由于疯牛病的原因，提取的PS产品安全性受到质疑，因此提取法已处于淘汰边缘。

与提取法相比，酶转化法[3]工艺简单、条件温和、产物收率高、低碳环保、产品安全，利用磷脂酶D的转磷脂酰基特性，催化PC合成PS，广泛引起了人们的关注。然而在磷脂酶D催化大豆磷脂（PC）合成PS的过程中，体系释放出另一种产物胆碱，其与磷脂酶D相互作用，降低酶的活性，致使反应速率减慢，产品收率低。为了最大程度地提高反应收率，需将从反应混合物中移除胆碱。JUNEJA等[4]曾在该反应中加入胆碱氧化酶和过氧化氢酶去除胆碱，但这两种酶比较昂贵，难以在大规模的工业中使用。本文采用反复分批式反应[5]实现了反应混合物中胆碱的移除，进而大大提高了反应收率。

1　材料与方法

1.1仪器与设备

台式恒温生化摇床，ZHWY-211C，上海智成分析仪器制造有限公司；分析天平，T-114，北京赛多利斯仪器系统用限公司；扫描仪，Pro800，佳能电器有限公司；薄层展开缸，PQ，上海信仪仪器有限公司；GF254薄层板，由实验室自制；玻璃毛细点样管，0.5mm×100mm，国药集团化学试剂有限公司。

1.2试剂与材料

磷脂酶D，由本实验室保存的链霉菌株发酵制备；大豆磷脂，90％，北京美亚斯磷脂技术有限公司；氯化胆碱，国药集团化学试剂有限公司；SiO2，30nm，阿拉丁试剂；L-丝氨酸，无锡市必胜化工产品有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1磷脂酶D的固定化

由一株链霉菌发酵制备得的游离磷脂酶D一般为粗酶液。可采用乙醇分级沉淀法进行纯化[6]：0℃，搅拌条件下，向粗酶液中快速滴加等量冷冻无水乙醇，冷冻离心去沉淀并收集上清液。以相同方式于0℃向清液中补加3倍量的冷冻乙醇，冷冻离心去清液并收集沉淀，反复多次后，获得比活力为8.88 U/mg的纯化磷脂酶D，达粗酶液比活力的12倍。

分离纯化后的游离磷脂酶D与纳米SiO2充分混合，置于摇床内吸附反应若干小时。校调体系pH值至一定值，在0℃、搅拌条件下快速滴加冷冻乙醇进行沉淀聚集，聚集后的沉淀与25％戊二醛交联剂进行反应，洗涤后获得固定化磷脂酶D。

1.3.2磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸

固定化磷脂酶D催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸的反应是在两相体系中进行的，即大豆磷脂溶于有机溶剂乙醚，L-丝氨酸（PC浓度的100倍，大大过量）溶于0.2mol/L pH值为5.5的乙酸缓冲液。二者混合后加入固定化磷脂酶D，28℃、摇床转速200r/min下在两相界面上发生反应，对有机相进行间歇取样，并用薄层色谱（TLC）进行分析。

磷脂酶D的转酯活力被定义为：28℃下，单位时间内合成1μmol PS所需的固定化酶量，即为一个酶活力单位（1U）。

1.3.3抑制剂氯化胆碱的添加

在上述转酯反应条件下，设置几组平行实验进行研究，分别添加不同浓度的氯化胆碱于水相体系中进行反应，间歇取样分析，观测胆碱的抑制作用。

1.3.4反复分批式反应

在上述转酯反应条件下，每隔1h将水相从反应混合物中分离出来，缓冲液中的固定化磷脂酶D经滤纸过滤，并用乙酸缓冲液反复冲洗3次，回收进行二次利用。在反应体系中，添加新鲜的L-丝氨酸乙酸缓冲液为新的水相，进行第二批次的反应。反复进行多次，间歇取样，进行磷脂的测定。

1.4磷脂分析方法

磷脂样品用TLC检测分析，GF254硅胶制成薄层板，取样，点样，走板，采用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸=13∶5∶0.8∶0.8（体积比）的展开剂展开，碘蒸气染色。染色后用薄层扫描仪扫描，利用Photoshop和Gel-Pro分析仪计算斑点灰度值，计算出各种磷脂浓度。

2　结果与讨论

2.1不同底物PC浓度对PS合成的影响

考察不同底物PC浓度对PS合成的影响，由图1可知，反应90min后，当底物PC浓度为2mmol/L、6mmol/L、10mmol/L时，PS收率分别为57.34％、43.6％、38％。反应3.5h后，3种PC浓度所对应最大PS收率分别达57.34％、48.8％、48.2％。由图1可知，随着底物PC浓度的增大，PS的收率由57.34％降低到38％ 。

图1　不同底物PC浓度对PS合成的影响

2.2不同胆碱浓度对PS合成的影响

在转酯反应的水相中分别添加0、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L的氯化胆碱，其中PC浓度为2mmol/L，考察胆碱浓度对PS合成的影响。由图2可知，初始转酯速率随着胆碱浓度的增加而呈现减小的趋势。由于单位质量的酶催化磷脂量是一定的，而胆碱的加入会占用酶的立体空间，使底物与酶结合的概率变小，酶与中间产物不能及时结合进行下一步反应，致使催化反应速率会降低。胆碱含量较小时，抑制作用不明显，胆碱含量越多，其抑制作用突出，胆碱浓度为6mmol/L时，速率由100％降至49.4％。

图2　胆碱浓度对转酯反应速率的影响

2.3反复分批式反应合成PS

反复分批式反应指不断更换水相，即在高PC浓度（10mmol/L）下，移除水相中的胆碱，从而提高催化反应速率。由图3所示，发现运用不同的操作方法，磷脂酶D催化的转酯速率随着反应时间的推移呈现持续减小的趋势，分别在1h和2h换料并添加新的水相的情况下，换料后的催化反应速率明显高于不换料的情况下，即1h时，反应速率增大8.9％，2h时速率增大38％，两次换料后PS收率达67％。

图3　反复分批式操作对转酯反应速率的影响

2.4固定化PLD在合成PS中的操作稳定性

由图4可知，固定化磷脂酶D在反复10批次反应后，仍保持较高的催化活性，其活力为58％。说明纳米SiO2的球状颗粒能紧锁住固定在其上的酶分子，使酶的催化性能稳定，更好地适用于反复分批式反应。

图4　固定化PLD重复使用次数与酶活力的关系

3　结论

增大底物（PC）的浓度，转酯反应速率及PS的收率都降低，这可能是发生了可逆反应，或者反应过程中生成副产物胆碱，抑制酶的催化活性。本文在低底物PC浓度（2mmol/L）下，添加不同浓度的氯化胆碱，发现转酯反应速率及PS收率大大降低；在高底物PC（10mmol/L）下，采用反复分批式反应，不断更换水相，即移除水相中的胆碱，发现第二次换料后，转酯速率增大38％。这证明在转酯反应中副产物胆碱的存在，大大抑制反应的进行，采用反复分批式反应，去除胆碱，能有效提高PS的生产能力。反复10批次生产PS后，纳米SiO2固定化PLD仍保留58％的相对活力，催化性能稳定。反复分批式反应工艺简单，条件温和，也可以应用于其他稀有磷脂的生产。

参考文献

[1]王兆明，贺稚非，余力，等.动物源卵磷脂功效作用及其分析方法[J].食品工业科技，2014，35（9）：362-365.

[2]刘代成，杨雅婷.一种从动物脑提取磷脂酰丝氨酸的方法：200410024225[P].2005-02-23.

[3]胡飞，段章群，王淮，等.生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的研究进展[J].油脂化工，2012，37（6）：54-58.

[4]JUNEJA L R，TANIGUCHI E，SHIMIZU S，et al.Increasing Productivity by removing choline in conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by phospholipase D[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1992，73：357-361.

[5]JUNEJA L R，HIB N，YAMANE T，et al.Repeated batch and continuous operations for phosphatidylglycerol synthesis from phosphatidylcholine with immobilized phospholipase D[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，1987，27：146-151.

[6]姚娜，张小里，赵彬侠，等.磷脂酶D催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸工艺[J].化工进展，2011，30（s1）：281-285.

Increasing productivity of phosphatidyserine by repeated batch reaction

FENG Juanjuan1，ZHU Nannan1，DENG Yangmin1，HAN Xiaoling2，ZHANG Xiaoli1，ZHAO Binxia1
（1College of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China;2Xi’an LIBANG Pharmaceutical Company Limited，Xi’an 710075，Shaanxi，China）

Abstract：The synthetic reaction of phosphatidyserine from soybean lecithin catalyzed by immobilized phospholipase D was carried out in oil-water two phase system，with PC and L-serine rich in oil and water phase，respectively. However，the by-product choline restrains the enzyme-catalyzed reaction rate and should be removed in time. In order to solve this problem，we adopted the repeated batch reaction. Increasing the substrate (PC) concentration decreased the yield of PS greatly. When various concentrations of choline chloride were added into the reaction mixture at low PC concentrations，there was a significant decrease in transphosphatidylation rate and the yield of PS. The using of repeated batch reaction was examined at high PC concentration to remove choline，the transphosphatidylation rate increased by 38％，and PS yield was 67％. The paper reported that the repeated batch operation is a novel technology for the synthesis of phosphlipid and increased the productivity of PS significantly. And the immobilized enzyme activity remained 58％ after ten batches and nano-SiO2-immobilized-PLD was suitable for repeated batch reaction.

Key words：phosphatidyserine; immobilized phospholipase D; repeated batch reaction; choline

中图分类号：TQ 463

文献标志码：A

文章编号：1000–6613（2016）04–1180–04

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.034

收稿日期：2015-08-24；修改稿日期：2015-10-21。

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2014JM2057）。