生物样品中阿霉素的分析方法优化研究

刘匡一　彭秘　李晗芸　刘亚丽　苏丹

摘 要 目的：运用高效液相质谱联用（LC-MS）技术对阿霉素体内血浆分析方法进行优化，为更好地对药物进行体内血浆药物定量分析奠定基础。 方法：液相方面，考察不同的色谱柱，从中选择响应好的作为分析的色谱柱，同时，以高响应为前提，选择合适流动相和梯度条件；对于质谱，选择母离子和子离子，优化碰撞电压、毛细管电压等参数；进样前，对血浆样品的前处理中提取条件方面进行优化，筛选出合适的萃取有机溶剂并选择合适的内标。结果：该方法快速、灵敏、有效，适合阿霉素的体内血浆药物定量分析。

关键词 阿霉素 分析方法 生物样品

中图分类号：R914.2 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2016.02.068

Abstract Objective： LC-MS （high performance liquid chromatography mass spectrometry） method was used to optimize the plasma analysis method in vivo， and to lay the foundation for the quantitative analysis of drugs in vivo. Methods： In Liquid phase. The effects of different chromatographic column， the selection response as a chromatographic column. At the same time， with high response as the premise， select the appropriate mobile phase and gradient conditions； parameters for mass spectrometry， select the parent ion and ion， optimization of impact voltage and capillary voltage is needed； sampling of the extraction conditions were optimized and screened a suitable organic solvent extraction and choose the appropriate internal standard. Results： This method is fast， sensitive and effective， and is suitable for the quantitative analysis of Adriamycin in vivo.

Key words adriamycin； analysis method； biological samples

阿霉素，又称多柔比星，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，①抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。是临床常用的蒽环类抗恶性肿瘤的药物，可广泛用于肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等的化疗。②

高效液相色谱-质谱联用技术（high-performanceliq id chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是以高效液相色谱为分离手段，以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术。它将高效液相色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有的高选择性、高灵敏度以及能够提供分子量与结构信息的优点结合起来，在中药研究中得到广泛应用。③④质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。⑤串联质谱（MS /MS）在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。⑥本文通过多反应监测（MRM）数据采集方式对阿霉素母离子和子离子进行扫描确认，优化质谱参数，为血浆样品的分析奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-MS ：安捷伦的1290 Infinity快速液相色谱 安捷伦6460三重四极杆MS / MS；HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； BF-200 氮气吹干仪（北京优晟联合科技有限公司）。

1.2 试剂

阿霉素盐酸盐（批号246-818-3）为标准品，购自Sigma公司；长春新碱（批号3924631）为标准品和内标物，购自Sigma公司；甲酸为色谱纯，购自Sigma-Aldrich公司；乙腈为色谱纯，购自Fisher Scientific公司；丙酮为分析纯，购自广东省精细化学品工程技术研究开发中心；乙醚为分析纯，购自上海实验试剂有限公司；二氯甲烷为分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂；异丙醇为色谱纯，购自Fisher Scientific公司。

2 色谱条件优化

2.1 色谱柱的筛选

本研究对3个不同厂家不同型号的4根色谱柱（Phenomenex L na C18 4 m 50？.1mm；Waters C18 1.7 m 50？.1mm；Angilent Proshe C18 2.7 m 75？.1mm；Waters XSELECTTM CSHTM C18 5 m 50？.6mm）进行了测试。

2.2 流动相梯度条件的选择

合适的流动相及梯度条件时保证分析测定准确性和稳定性的前提，本实验分别考察水相，有机相及梯度对生物样品中阿霉素测定的影响。

2.3 血浆样品的前处理

考察沉淀蛋白法和液-液萃取法两种类型的样品前处理方法。对于萃取溶剂考察了二氯甲烷与异丙醇（4：1）、二氯甲烷、丙酮、乙醚。

在沉淀蛋白法中，取100 L空白血浆，加入高，中，低三种不同浓度的阿霉素（0.025 g/ml、0.5 g/ml、1 g/ml），同时加入内标与乙腈， 振荡涡旋（3min），离心（16000rpm，10min），取上清200 L进样，每个不同的浓度各平行三份。

对于液-液萃取法，取100 l空白血浆，加入高，中，低三种不同浓度（同上）的阿霉素，同时分别加入内标与萃取溶剂（二氯甲烷与异丙醇（4：1）、二氯甲烷、丙酮、乙醚）， 振荡涡旋（3min），离心（16000rpm，10min），取上清200 L，进样，每个不同的浓度各平行三份。

2.4 内标物的选择

为了以后更好地定量分析体内血浆药物浓度，选择恰当的内标，该内标应不影响药物的结构，不与药物发生反应，出峰时间应与药物有明显的区别。

3 质谱条件的优化

本研究对血浆中阿霉素数据的采集采用MRM方式，考察了阿霉素的母离子与子离子，并优化了进样条件下质谱的毛细管电压与碰撞气能。

4 结果

4.1 色谱柱选择

实验结果表明，Waters XSELECTTM CSHTM C18（5 m 50 ？4.6mm）柱最适合进行分离，所获得的色谱峰最佳，保留时间合适，且显著避免了峰的拖尾。典型色谱图如图1。

4.2 流动相选择

4.2.1 水相及其pH 值对色谱行为的影响

流动相pH 值对样品的分离有较大影响，调低pH 值后，便得到尖锐的峰型。向流动相中加入少量甲酸，可以使待测组分的离子化程度增加，质谱信号强度增大；而且，流动相酸性的增加，可以减少由于待测物分子结构中碱性胺基侧链与硅胶柱中未完全硅烷化的硅醇基相互作用所导致的色谱峰拖尾和峰展宽现象，使化合物快速被洗脱，从而缩短了每次的分析时间，实现了生物样品分析所要求的灵敏、快速和高通量测定。

4.2.2 流动相梯度条件的选择

为了使所检测的色谱峰分离度好，出峰时间合理，采用梯度洗脱方法。阿霉素极性相对较小，适宜在乙腈比例较大的系统中分离，为了保证待测物与内标较好的峰型和适合的保留时间，同时避免内源性物质的干扰，本实验进行了不同梯度比例的优化，最终确定 0 min 到2.5min 范围内，水相比例由75%到10%，再回到75%，色谱柱平衡2.5min。在此梯度条件下阿霉素与内标可同时测定，峰型较好，符合测定要求同时又节了省分析时间。

4.3 提取条件选择

通过对各萃取溶剂所得峰形与提取效率的比较，最终选择萃取剂为二氯甲烷：异丙醇（4：1）。各溶剂的提取效率见表1。

表1 各提取溶剂下阿霉素的峰面积响应值

4.4 内标物的选择

理想的内标应该与待测组分理化性质比较接近，在待测物的色谱条件、样品处理过程中都能保持与待测物的一致性。在提取的过程中，内标应该能追踪待测组分，以补偿待测组分提取回收率改变所发生的变化。根据以上内标选择原则，本实验中的内标物，选择了与阿霉素相似，具有一分子伯胺基的长春新碱，其提取条件、衍生过程及衍生物的色谱保留行为均与阿霉素十分相近，从而有效保证了定量分析方法的精密与准确。

4.5 质谱条件优化

本研究采用的离子源为ESI，正离子模式，数据采集采用MRM 方式。阿霉素和内标的分子结构中均含有碱性基团，经考察后发现正离子方式检测相对于负离子方式检测能够得到更好的质谱响应，因此选用了正离子方式检测。

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（1）母离子和子离子的选择。阿霉素分子结构中因为含有一个氨基，氨基易得一氢离子生成氨根正离子，所以母离子为（m/z 544.2）在选择阿霉素离子时，由于碳杂键容易断裂，断裂生成的离子（m/z 360.9）稳定且信号强。

（2）毛细管电压的选择。在试验过程中发现阿霉素对照品在毛细管电压大小约125v 时的电离效果较好，电压减小会影响化合物的电离效果，降低响应信号。

（3）碰撞气能的选择。碰撞气是母离子裂解产生子离子的一个重要条件，当碰撞气流速大小设定在30v 时，信号响应比较稳定。

5 讨论

本实验完成了对血浆中阿霉素分析方法优化的研究，确定了Waters XSELECTTM CSHTM C18（5 m 50？.6mm）色谱柱，内标长春新碱、合适的浓度梯度和准确的质谱参数，在选择提取溶剂方面，筛选了四种有机溶剂，确定了萃取剂为二氯甲烷：异丙醇 4：1的溶液，并再一次在此基础上优化生物样品复溶方法，使色谱峰的峰型更好，响应更高。通过以上实验，最终确定了最优的色谱，质谱条件，解决了峰展宽和拖尾的问题，并能够满足快速、灵敏、高通量的阿霉素血浆生物样品分析测试要求。

通讯作者：刘亚丽，苏丹

注释

① Cutts S M， Phillips D R. Use of oligonucletides to define the site of interstand cross-links induced by Adriamycin[J]. Nucleic acids research，1995.23（13）：2450-2456.

② Young R C， Ozols R F， Myers C E. The anthracycline antineoplastic drugs[J].New England Journal of Medicine，1981.305（3）：139-153.

③ 刘丽芳.药品标准中 HPLC 法色谱条件的优化与系统适用性试验的重要性[J].中国药品标准，2005.6（1）：3-6.，

④ 邵清松，胡润淮.高效液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用[J].中医药学报，2007.35（3）：44-47.

⑤ 庞焕，文允镒.质谱联用技术研究进展及其在药物分析中的最新应用[J].中国药学杂志，2004.36（7）：433-435.

⑥ 李忠红，王玉，倪坤仪.LCMSn在药物分析中的应用[J].药物分析杂志，2004.24（3）：341-344.