基于液相色谱

林敏 熊昕 余婷婷 张莉 刘迪

三唑酮是一种高效、低毒、持效期长、内吸性强的三唑类杀菌剂，但随着农药的滥用，各种农药对环境的污染越来越严重，因此国内外对三唑酮残留限量有较严格的规定，目前我国现有农药检测方法缺点是操作繁琐，同时准确度不高，检测过程时间长，既繁琐，又不安全。高效液相色谱法是一种较为先进的检测技术，可以有效检测食品安全问题。在食品检测中，利用安全、高效的检测方法，可以及时检测出食品中的有害成分，保障食品安全，可以防止有害食品进入市场，有效降低食品的安全风险，目前被广泛应用于食品检测工作当中。

试验材料

材料。（1）仪器与设备。超高效液相色谱质谱联用仪，Pipet-LiteXLS型移液器，RetschGM200型组织捣碎机，TGL-16M型高速离心机，N-EVAP型氮吹仪，Sep-PakVac型氨基固相萃取柱，RE-52AA型旋转蒸发器。（2）试剂和材料。三唑酮，乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，甲苯为优级纯，实验室用水为超纯水；氯化钠为优级纯，无水硫酸钠为分析纯，用前在650℃下灼烧4h，贮于干燥器中，冷却后备用。

三唑酮标准溶液：精密称取三唑酮标准品0.1000g于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，此溶液1mL相当于1.00mg三唑酮。临用时，用乙腈稀释至所需的质量浓度。

色谱条件。不同流动相色谱条件见表1。色谱柱：WATERSACQUITYC18（50×2.1mm，1.7μm）型；进样量：10μL；柱温：40℃。

质谱条件。电离模式：ESI+；扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔流速：50L/Hr；脱溶剂气流速：900L/Hr；碰撞气流速：0.17mL/min；母离子：294.2；子离子：197.1（定量离子），225.2；锥孔电压：25V；碰撞能量：15，13eV。

试验方法。（1）样品的提取。称取样品20 g于80 mL塑料离心管中，加入40 mL乙腈，用高速组织捣碎机在转速15 000 r/min 下匀浆提取1 min，加入5 g NaCl，再匀浆提取1min，以4 000 r/min离心5min，取上清液20 mL （相当于10 g 试样量），在40 ℃水浴中旋转浓缩至1 mL，待净化。（2）提取液的净化。在Sep-Pak Vac 型柱中加入约2 cm 高无水硫酸钠，并放入下接鸡心瓶的固定架上。加样前先用4 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，并更换新鸡心瓶接收。再每次用2 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 洗涤样液瓶3 次，并将洗涤液移入柱中。在柱上加上50 mL 贮液器， 用25 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 洗脱农药及相关化学品合并于鸡心瓶中，并在40 ℃水浴中旋转浓缩至净干。将浓缩液置于氮气吹干仪上吹干，迅速加入1 mL 的乙腈+ 水（3+2）混匀，经0.2 μm 滤膜过滤，供UPLC-MS/MS 分析。

线性关系。选择不含有三唑酮的苹果为果蔬样品代表。准确称取20 g （精确至0.01 g） 未添加三唑酮的苹果匀浆液，准确加入三唑酮的对照品溶液，使样品中三唑酮的质量浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0， 100.0 ng/mL， 分别对这些溶液进行UPLCMS/MS 分析，记录MRM 图，得峰面积，并对各溶液的峰面积和质量浓度进行线性回归分析，得到线性回归方程和相关系数。

检出限与定量限。检出限与定量限是衡量方法灵敏度的指标之一。将对照品溶液逐级稀释， 分别对这些溶液进行UPLC-MS/MS 分析，记录MRM 图中定量离子的信噪比，以3 倍信噪比计算得出检出限，10 倍信噪比计算得出定量限。

回收率和精密度测定。选择不含有三唑酮的西红柿为果蔬样品代表。按照加样回收法低、中、高3 个水平对空白样品进行加标，每个质量浓度平行3 份，使西红柿样品中三唑酮的添加量为0.125，0.250，0.500 μg/kg，按照1.4 方法进行样品处理。按照色谱- 质谱方法进样，计算每个质量浓度下的回收率，同时计算相对标准偏差。

结果与分析

线性关系。选用三唑酮的溶液质量浓度为1.0-100.0 ng/mL的样品溶液进样分析，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。得到标准曲线为Y=2 091.3X-778.58，R2=0.999 8。线性关系良好，完全符合方法学要求。

三唑酮的标准工作曲线见图1，三唑酮标准溶液的MRM 见图2。

检出限与定量限。对逐级稀释溶液中三唑酮的质量浓度进行分析，将所得MRM 图中的色谱峰进行信噪比计算。质量浓度为0.5 ng/mL 时，信噪比大于3 倍空白信噪比，得出检出限为0.5 ng/mL。质量浓度为1.0 ng/mL 时，信噪比大于10 倍空白信噪比，得出定量限为1.0 ng/mL。

回收率与精密度。苹果样品中三唑酮的回收率与精密度见表2

苹果样品中回收率为82.8%～94.7%。根据国家标准GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范食品理化检测中对检测方法确认的技术要求中，被检测组分浓度含量小于0.1 mg/kg 时，回收率达到60%～120%，即符合方法学的要求。计算各质量浓度下平行3次的试验结果，计算相对标准偏差。

实际样品分析。依照以上的试验方法对市场上出售的几种蔬菜水果进行检测，结果表明，结果表明被检测的几种蔬菜水果中，均未检出三唑酮。

讨论

试验建立了一种快速检测水果蔬菜中三唑酮农药残留的液相色谱-串联质谱法的检测技术， 该方法回收率在84.9%～89.3%之间，完全符合方法学要求。该方法前处理简单，具有灵敏度高、分离效果好、重复性强等特点，适用于短时间内大批量测定蔬菜水果中的三唑酮。

（作者单位：林敏 余婷婷 张莉 刘迪 湖北省食品质量安全监督检验研究院；熊昕 湖北省食品药品监督管理局技术审评核查中心）