青年人胃癌中Cathepsin B的表达及意义

何琳莉，文　彬,蹇顺海

(川北医学院，四川 南充　637000)



青年人胃癌中Cathepsin B的表达及意义

何琳莉，文彬,蹇顺海

(川北医学院，四川 南充637000)

摘要：检测了Cathepsin B在青年人胃癌组织中的表达，探讨其与肿瘤发生机制的关系。采用免疫组化方法(S-P法)及原位杂交法检测Cathepsin B蛋白及其mRNA在52例青年人胃癌组织、15例胃高级别上皮内瘤变组织及15例癌旁组织中的表达；分析Cathepsin B的表达与患者临床病理特征的关系。结果表明：青年人胃癌中Cathepsin B阳性表达率显著高于胃高级别上皮内瘤变(P<0.05)，癌旁组织不表达，且有淋巴结转移及远处转移的患者表达增高(P<0.05)；Cathespin B mRNA在胃癌中高表达，非癌组织中几乎不表达，与蛋白表达基本一致。说明Cathepsin B的高表达在青年人胃癌发生、发展过程中起重要作用，其表达水平可能成为提示胃癌转移的良好指标。

关键词：青年人胃癌；免疫组织化学；原位杂交

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率以及死亡率位居我国各种恶性肿瘤之首[1]。近年来，胃癌的发病规律有所变化，青年人(年龄≤35岁)胃癌的发病率呈上升趋势[2]。大量研究表明：青年人胃癌具有更强的侵袭及转移能力，而胃癌的预后与胃癌分化、浸润及转移密切相关[3-4]。

组织蛋白酶B属于半胱氨酸蛋白酶，主要存在于胞浆溶酶体中，可降解多种细胞外基质，维持细胞内外蛋白水解的平衡。目前多数研究认为高表达的Cathepsin B与肿瘤的恶性进展关系密切[5]。在膀胱癌、肺癌、口腔癌、胰腺癌等恶性肿瘤中检测到Cathepsin B表达增强，且与肿瘤的转移密切相关[6-8]。目前在胃癌与Cathepsin B表达的相关性方面的研究较少。本文采用免疫组化及原位杂交法检测青年人胃癌组织中Cathepsin B蛋白及其mRNA的表达，并结合患者临床病理参数探讨其在胃癌发生、发展过程中的作用。

1材料与方法

1.1标本

收集2003—2013年川北医学院附属医院病理科确诊存档的青年人胃腺癌标本52例(患者年龄≤35岁，参照国内多数文献报道对病人年龄段分组纳入本研究)，将15例胃高级别上皮内瘤变组织及15例癌旁组织作为对照组。癌旁组织均含有胃黏膜，经HE染色确诊胃黏膜上皮细胞形态正常，无癌细胞累及。

1.2主要试剂及抗体

Cathepsin B兔抗人单克隆抗体购自美国epitomics公司；Cathepsin B原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司；二步法即用型检测试剂及DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术开发公司。

1.3免疫组化

采用EnVision两步法检测Cathepsin B蛋白的表达情况。所用石蜡块组织均经连续切片、常规脱蜡、水化、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶、滴加一抗、滴加二抗、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明处理、封片等步骤。结果判定：cathepsin B表达部位主要位于癌细胞胞浆，部分位于细胞核内。使用DAB显色系统染色，阳性结果为细胞浆内弥漫分布染色明显的棕黄色颗粒。在光学显微镜下观察(随机选取5个高倍视野)，根据阳性细胞的染色强度及百分率计分[9]，其中：染色阳性细胞百分率小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，50%～75%为3分，大于75%为4分；细胞基本无着色为0分，细胞为浅黄色为1分，细胞为棕黄色为2分，细胞为棕色为3分。阳性程度按照上述两项的乘积判定：0分记录为阴性(-)，1～4分记录为弱阳性(+)，5～8分记录为中度阳性(++)，9～12分记录为强阳性(+++)。

1.4原位杂交

石蜡切片常规脱蜡至水、3%过氧化氢灭活(10 min)、3%胃蛋白酶消化(10 min)、0.1 MPBS缓冲液后固定、滴加预杂交液、电热恒温箱42 ℃孵育(3 h)、滴加杂交液、电热恒温箱42 ℃孵育(24 h)、SSC缓冲液洗涤切片、滴加封闭液、滴加ISH(1 h)、电热恒温箱42 ℃孵育(1 h)、DAB显色(10 min)、苏木素复染(5 min)、酒精脱水(15 min)、封片。结果判定：使用POD/DAB显色系统，阳性信号呈棕黄色，主要位于细胞浆，少数细胞核着色。随机选取5个高倍视野(每个视野细胞数量大于200)，将阳性细胞数大于等于5定为阳性。

1.5统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，各组间比较采用χ2检验。

2结果

2.1不同胃组织中Cathepsin B蛋白的表达

Cathepsin B蛋白定位于细胞浆，在癌旁组织、胃高级别上皮内瘤变组织及胃癌组织中的阳性率分别为0，13.3%，59.6%(图1)。Cathepsin B在癌旁组织中无表达，在胃高级别上皮内瘤变组织中有2例表达。在胃癌组织中的阳性表达率与胃高级别上皮内瘤变组织相比显著增高，且染色强度明显加强，差异具有显著性(P<0.01，见表1)。

图1　Cathepsin B蛋白的表达

组别nCathepsinB-++++++癌旁组织1515000胃高级别上皮内瘤变组织1513110胃癌组织522161114

2.2胃癌中Cathepsin B蛋白的表达与临床病理参数的关系

Cathepsin B蛋白在淋巴结有、无转移组的阳性率分别为72.4%,43.5%；有、无远处转移组的阳性率分别为90.9%,51.2%；浸润深度组中，T3—T4期、T1—T2期的阳性率分别为70.2%,33.3%。统计结果显示:Cathepsin B蛋白的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关(P<0.05)，但与患者性别、分化程度、肿块大小、临床分期无明显相关性(P>0.05)。具体情况见表2。

表2　Cathepsin B蛋白表达与临床病理参数的关系

2.3不同胃组织中Cathepsin B mRNA的表达

Cathepsin B mRNA阳性信号位于细胞浆。在癌旁组织、胃高级别上皮内瘤变组织及胃癌组织中的阳性率分别为0，6.7%，51.9%(见图2)。Cathepsin B mRNA 在癌旁组织中无表达，在胃高级别上皮内瘤变组织中仅有1例微弱表达。胃癌中的阳性表达率显著高于胃高级别上皮内瘤变组织(P<0.01)，与蛋白表达基本一致(见表3)。

图2　Cathepsin B mRNA的表达

组别nCathepsinB-++++++癌旁组织1515000胃高级别上皮内瘤变组织1514100胃癌组织522551012

3讨论

浸润、转移是恶性肿瘤的特征性表现，也是多数实质性恶性肿瘤难以治愈的原因。胃癌与其他恶性肿瘤一样，其侵袭转移是涉及多因素、多阶段的连续动态过程。其中，基底膜成分的降解与肿瘤的恶性进展关系极为密切[10]。在这复杂的病理生理过程中，肿瘤细胞与其周围的基质细胞可分泌多种酶降解细胞外基质，促使肿瘤细胞浸润、转移。Cathepsin B属于半胱氨酸蛋白酶类，是一类主要存在于溶酶体中的胞内蛋白酶，其家族成员包括数十种亚型，如B、K、L、M、N、H等，目前研究较为多见的是B、L、D型。在生理状态下，Cathepsin B可发挥降解多种蛋白质的重要作用，维持细胞内外蛋白水解的平衡。而在病理状态下，Cathepsin B能水解多种细胞外基质成分，如IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等，参与肿瘤的浸润、转移[11]。目前，在多种实体恶性肿瘤中可检测到Cathepsin B的高表达[12-14]。Ma等[15]研究发现：Cathepsin B在正常人食管黏膜无表达，而在食管癌及食管癌前病变中表达增高，并且在食管鳞癌裸鼠移植瘤模型中发现Cathepsin B高表达。在宫内膜癌的研究中发现[16]：Cathepsin B在宫内膜癌中的阳性率显著高于正常宫内膜，且在抑制宫内膜癌细胞株中Cathepsin B基因后癌细胞增殖能力显著降低。在另一项关于胃癌的研究中发现[17]：Cathepsin B在胃癌中活性显著增高是其独有的恶性表现，可能与肿瘤进展相关。Ebert 等[18]实验发现：Cathepsin B在胃癌组织中的阳性表达率为98%，在胃癌患者血清中的阳性率显著高于健康对照组(P<0.01)，有远处转移者血清水平明显增高(P<0.05)，且Cathepsin B 血清水平高于129 pmol/L的患者生存率降低(P<0.05)，表明Cathepsin B可以作为胃癌诊断中判断患者预后的潜力指标。但Czyzewska等[19]研究认为：Cathepsin B表达水平仅与患者淋巴结转移有关，与患者5年生存率无相关性，因此Cathepsin B不能作为提示胃癌患者预后的独立因素。

本文用青年人胃癌标本、胃高级别上皮内瘤变组织、癌旁组织研究Cathepsin B蛋白及mRNA的表达。结果显示：Cathepsin B蛋白及mRNA在癌旁组织均无表达；在胃癌组织中，无论是蛋白阳性表达率、表达强度或是 mRNA阳性表达率及表达强度均显著高于胃高级别上皮内瘤变组织，说明Cathepsin B表达增加可能是胃癌发生、发展的重要基础。在本次实验中，mRNA表达总体阳性率低于蛋白表达阳性率，但其结果分析与前者基本一致，这可能与检测手段的敏感性不同有关。有报道指出，Cathepsin B在多种肿瘤浸润边缘处有表达增强的情况发生[20-21]。本研究发现其在胃癌组织的良-恶性分界处表达明显，这可能与Cathepsin B参与肿瘤细胞对周围组织的粘附及对细胞外基质屏障的降解有关。此外，在有淋巴结转移组、远处脏器转移组及浸润浆膜层组中均出现Cathepsin B蛋白的表达增加，提示Cathepsin B有可能成为判断胃癌恶性程度、提示高转移风险的生物学指标之一。

综合以上分析， Cathepsin B在癌旁组织无表达，在青年人胃癌组织中高表达，且与淋巴结转移等临床病理参数有关。提示Cathepsin B与青年人胃癌发生、发展密切相关，有可能成为诊断胃癌的有效指标之一，且为胃癌的靶向治疗提供新的思路，具有广泛的研究前景。

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(责任编辑何杰玲)

Expression of Cathepsin B and Its Significance in Gastric Cancer Tissue of Young Patient

HE Lin-li, WEN Bin, JIAN Shun-hai

(North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China)

Abstract:Cathepsin B expression in gastric cancer tissue in young people was detected and its relationship with the tumorigenesis mechanism was explored. The immunocytochemistry method (S-P method) and in-situ hybridization method were adopted to detect Cathepsin B and the expression of mRNA in 52 cases of gastric cancer tissues, 15 cases of gastric bypass high-grade intraepithelial neoplasia and 15 cases of cancer tissues. The positive rate of Cathepsin B in the gastric cancer tissue of non-selected people significantly exceeds non-typical gastric proliferating tissue, and there is no expression of normal appearing tissue(P<0.05). And there is a rise of expression among lymphatic metastasis and distant metastasis among young patients(P<0.05). The high expression of cathespin B mRNA in stomach cancer and the no expression in non-cancer tissue, which is in accord with the expression of protein. The high expression of Cathepsin B in gastric cancer occurrence and development plays an important role in the process and its expression level may be prompted a good index of the gastric cancer metastasis.

Key words:young patients with gastric cancer; immunocytochemistry; in-situ hybridization

中图分类号：R735.2

文献标识码：A 1674-8425(2016)03-0069-05

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.03.012

作者简介：何琳莉(1989—)，女，四川南充人，硕士，主要从事消化道肿瘤的基础与临床研究。

收稿日期：2015-12-12

引用格式：何琳莉，文彬,蹇顺海.青年人胃癌中Cathepsin B的表达及意义[J].重庆理工大学学报(自然科学)，2016(3):69-73.

Citation format：HE Lin-li, WEN Bin, JIAN Shun-hai.Expression of Cathepsin B and Its Significance in Gastric Cancer Tissue of Young Patient[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2016(3):69-73.