厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用及对VEGF表达的影响

钟全强，吴洪文，欧夏妙，蒙　杰，唐景财

(1.广西医科大学第四附属医院暨柳州市工人医院，柳州 545005；2.广西桂林市人民医院，桂林 541002)



厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用及对VEGF表达的影响

钟全强1，吴洪文2▲，欧夏妙2，蒙杰2，唐景财2

(1.广西医科大学第四附属医院暨柳州市工人医院，柳州 545005；2.广西桂林市人民医院，桂林 541002)

【摘要】目的研究厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用及对血管表皮生长因子(VEGF)表达水平的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)法检测厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞分别作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测厄贝沙坦高、中、低三个剂量(7.2 μg/ml、3.6 μg/ml、1.8 μg/ml)对乳腺癌MCF-7细胞干预前后，乳腺癌MCF-7细胞中VEGF表达水平的差异，以顺铂作为阳性对照组(给药浓度为5 μg/ml)。结果厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC(50))为2.3 μg/ml；厄贝沙坦对细胞增殖有显著抑制作用，且随着浓度的增加而增强，三个剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01)；厄贝沙坦作用组中VEGF的表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 厄贝沙坦高剂量组和顺铂阳性对照组VEGF的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有显著抑制作用，可以下调血管表皮生长因子的表达水平。

【关键词】厄贝沙坦；乳腺癌MCF-7细胞；血管表皮生长因子；抑制作用

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂厄贝沙坦购自浙江华海药业股份有限公司；顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司；DMEM培养基、胎牛血清和胰岛素均购自杭州四季青生物工程公司：DMEM加1.0 mM丙酮酸钠，0.1 mM非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠，添加0.01 mg/ml胰岛素和10%胎牛血清。酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒购自江苏凯基生物科技有限公司；VEGF试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司(2～8℃保存)。

1.1.2试验细胞乳腺癌MCF-7细胞株由广西医科大学附属肿瘤医院提供(试验前，细胞保存于液氮罐中)。

1.1.3仪器MODEL550酶标仪：美国BIORAD公司；CO2培养箱：美国 thermo forma；超净工作台：苏州净化设备厂；倒置相差显微镜：日本Olympus。

1.2方法

1.2.1细胞培养本次试验所用的MCF-7细胞株经过复苏后，转移至培养瓶中，置于37℃，0.5% CO2的细胞培养箱中进行培养，细胞经过胰酶消化，传代培养后，取对数生长期的MCF-7细胞进行种板，显微镜下用细胞计数板进行计数，调整96孔板中细胞浓度约为5000个/孔。

1.2.2噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率以空白培养液组作为空白对照组，分别设置厄贝沙坦高剂量组、中剂量组、低剂量组三个组，给药浓度分别为7.2 μg/ml、3.6 μg/ml、1.8 μg/ml，顺铂作为阳性对照，给药浓度为5 μg/ml。MTT法测定厄贝沙坦对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响：采用MTT法检测厄贝沙坦高、中、低三个剂量组对乳腺癌细胞作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，运用MTT法检测厄贝沙坦三个剂量组干预后对乳腺癌细胞的生长抑制作用，取对数生长期细胞用于试验，用酶标仪以570 nm/630 nm双波长测定各组细胞吸光度(A)值，细胞增殖抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。重复上述试验3次，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)值，根据IC50值设定后续试验的作用浓度。

1.2.3ELISA法测定各组中VEGF的表达采用ELISA法测定各组中VEGF的表达，检测步骤均严格按照试剂盒说明书操作步骤实行，在450 nm测量样本的吸光度值(A)，测定的最小值为30 pg/ml，其结果按照标准曲线法换算成VEGF的含量(pg/ml)。

2结果

2.1MTT法的测定结果经计算，厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的IC50为2.3 μg/ml。在相同作用时间下(24 h、48 h、72 h)，随着厄贝沙坦给药浓度的增加，其对MCF-7细胞增殖的抑制作用逐渐增强(P<0.05或0.01)；在低、中、高三个剂量组，随着用药时间的延长，厄贝沙坦对MCF-7细胞增殖的抑制作用也逐渐增强(P<0.05或0.01)，表现出剂量依赖性及浓度依赖性。见表1、图1。

2.2ELISA法测定各组中VEGF的表达结果试验分为厄贝沙坦高、中、低三个剂量组和顺铂阳性对照组(5 μg/ml)，测定各组药物作用下细胞中VEGF的表达水平，以未给药物培养液作为空白对照组，厄贝沙坦高、中、低三个剂量组作用24 h、48 h、72 h后，分别与空白对照组24 h、48 h、72 h VEGF含量对比，差异有统计学意义(P<0.01)，厄贝沙坦高剂量组和顺铂阳性对照组VEGF的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1　各组药物对MCF-7细胞增殖抑制作用

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与低剂量组比较，bP<0.05，cP<0.01；与中剂量组比较，dP<0.01；同组与厄贝沙坦作用24 h比较，eP<0.05，fP<0.01;同组与厄贝沙坦作用48 h比较，gP<0.01。

图1 厄贝沙坦高、中、低三个剂量组对MCF-7细胞增殖抑制作用

表2　各组药物作用下细胞中VEGF表达水平

注：与空白对照组比较,aP<0.01。

3讨论

本研究结果表明：厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖有显著抑制作用，随着药物作用浓度的提高，以及作用时间的延长，其抑制作用呈时间、浓度依赖性，试验中还测定了厄贝沙坦对MCF-7细胞中VEGF表达水平的调控作用，结果发现：随着厄贝沙坦给药浓度的增加，可以显著下调肿瘤细胞中VEGF的含量，厄贝沙坦高、中、低三个剂量组分别与空白对照组比较差异有统计学意义。据此研究结果推测，厄贝沙坦对MCF-7细胞的抑制作用可能与其下调VEGF因子这一作用机制相关。另外，本研究结果也与国外相关的一些报道相印证，Tanaka N等[6]研究发现，肾素血管紧张素在促进肿瘤细胞的生长中具有重要作用。一些肾素血管紧张素抑制剂，如血管紧张素转化酶抑制剂(ACEIs)或血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂在临床应用后，可能会影响恶性肿瘤的进展。研究者通过对279例接受肾输尿管切除术的局部上尿路上皮细胞癌(确诊后分期为pTa-3NOMO)的病人，在肾素血管紧张素抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂干预下的预后数据进行回顾性分析，发现未给予RAS抑制剂对降低随后的肿瘤无转移生存率是一个独立危险因素。Mc Menamin UC等[7]研究了ACEIs和血管紧张素受体阻滞剂(ARBs)对肿瘤病人的疾病进展和生存期的关系后发现，使用ACEI/ARB后可以预防乳腺癌的复发和大肠癌的远处转移，但更可靠的证据仍需进一步研究。Vinson GP等[8]试验研究证明：血管紧张素Ⅱ通过AT1受体发挥作用，进而促进肿瘤细胞的增殖及血管生成，这些促进作用可以通过阻断血管紧张素Ⅱ而受到抑制。有关ACE的表达水平和分布或AT1受体在许多肿瘤疾病的差异表达的流行病学证据直接支持了这一研究结论，该结果也为使用高剂量的血管紧张素转化酶抑制剂和AT1(或AT2)受体阻滞剂在乳腺癌的治疗中提供可行性，但这些结论仍有待进一步深入研究，最近的研究主要集中在AT1受体介导的细胞内的信号调控通路。Napoleone E等[9]研究发现：RAS可以促进肿瘤细胞的增殖和血管的生成，ACEIs和血管紧张素Ⅱ-1受体阻滞剂有预防肿瘤的可能性，组织因子(TF)在肿瘤的进展与肿瘤的生长、血管生成及转移等过程相关。AT1受体竞争性抑制剂氯沙坦可以降低MDA-MB-231细胞中TF和血管生长因子的表达水平，从而对肿瘤的进展和预后产生影响。

本试验结果表明：血管紧张素-Ⅱ受体抑制剂厄贝沙坦可以显著下调肿瘤细胞中VEGF因子的表达水平，它对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制作用很可能与这一下调机制相关，由于肿瘤细胞中血管的生成及肿瘤的形成转移都和VEGF因子相关[10]，因此VEGF因子可作为评价抗肿瘤药物治疗效果的指标，而本研究中的厄贝沙坦有望为临床进一步联合用药进行抗肿瘤治疗提供新的方向。

参考文献

[1] 雷杰，费建东，刘振显，等．乳腺癌组织中Ang-2及VEGF的表达及意义[J].肿瘤防治研究，2008，35(4)：263-265.

[2] 杜宏道，盛薇，高希涛，等．VEGF-C、CXCR4 在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及意义[J].西安交通大学学报：医学版，2012，33(1)：75-78.

[3] 师秀琴，徐嵩龄，李醒亚．新辅助化疗对食管鳞状细胞癌组织中趋化因子受体-7和血管内皮生长因子-C表达的影响[J].郑州大学学报：医学版，2009，44(4)：705-707.

[4] 郭丽丽，刘近春．CXCR4、VEGF在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其意义[J].中国实用医药，2009，4(13)：1-3.

[5] Sinn BV,Darb-Esfahani S,Wirtz RM，et al．Vascular endothelial growth factor C mRNA expression is a prognostic factor in epithelial ovarian cancer as detected by kinetic RT-PCR in formalin-fixed paraffin-embedded tissue[J].Virchows Arch，2009，455(6)：461-467.

[6] Tanaka N,Miyajima A,Kikuchi E，et al．Prognostic impact of renin-angiotensin system blockade in localised upper-tract urothelial carcinoma[J].British journal of cancer，2012，106(2)：290-296.

[7] Mc Menamin UC,Murray LJ,Cantwell MM,et al．Angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin receptor blockers in cancer progression and survival: a systematic review[J].Cancer Causes Control 2012，23(2):221-230.

[8] Vinson GP,Barker S,Puddefoot JR.The rein-angiotensin system in the breast and breast cancer[J].Endocrine-related cancer 2012，19(1):R1-19.

[9] Napoleone E,Cutrone A,Cugino D,et al．Inhibition of the renin-angiotensin system downregulates tissue factor and vascular endothelial growth factor in human breast carcinoma cells[J].Thrombosis research 2012,129(6):736-742.

[10] 何守搞,黄燕,王超，等.表皮生长因子受体和转化生长因子Ⅱ型受体在胃癌组织中的表达[J].右江医学，2006，34(6)：587-589.

(编辑：潘明志)

Influence of Irbesartan on expression of VEGF and its inhibition effect on the proliferation of MCF-7 in breast cancer

ZHONGQuanqiang1,WUHongwen2▲,OUXiamiao2,MENGJie2,TANGJingcai2

(1.TheFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity—LiuzhouWorker'sHospital,Liuzhou545005; 2.ThePeople’sHospitalofGuilin，Guilin541002,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Irbesartan on expression level of VEGF (vascular epidermal growth factor) and its inhibition effect on the proliferation of MCF-7 in breast cancer. MethodsThe MTT method was used to detect the inhibition rate of irbesartan on the MCF-7 cells after effecting 24 h, 48 h and 72 h, respectively. Enzyme-linked immunoabsorbent assayed(ELISA) was used to detect the level of VEGF in MCF-7 cells influenced by the combination use of irbesartan(the dose of irbesartan were divided into high-dose, middle-dose and low-dose which was 7.2 μg/ml, 3.6 μg/ml and 1.8 μg/ml, respectively). Cis-platinum was taken as positive control group (concentration of drug was 5 μg/ml). Results The 50% inhibition concentration(IC(50))of irbesartan on MCF-7 was 2.3 μg/ml. Irbesartan can inhibit the MCF-7 cancer cells significantly, the inhibiting effect was enhanced while increasing the inhibitor's dosage, difference between the three dosage groups and the blank control group was statistically significant(P<0.05 or 0.01). Difference of expression levels of VEGF between the irbesartan effecting groups and blank control group was statistically significant(P<0.01), but difference between high-dose group and cis-platinum positive control group was not statistically significant(P>0.05).ConclusionIrbesartan can inhibit the proliferation of MCF-7 cancer cells in breast cancer significantly, and lower expression levels of VEGF.

【Key words】irbesartan; MCF-7 cells in breast cancer; VEGF; inhibition effect

(收稿日期：2015-11-04修回日期：2016-02-25)

中图分类号：R739.9

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.005

作者简介：钟全强，男，主管药师，硕士研究生。E-mail:zhongquanqiang@126.com▲通信作者：吴洪文。E-mail:wuhongwen5918@163.com

基金项目：广西壮族自治区卫生厅科研计划课题(Z2014682)

国内外众多研究表明：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是调节肿瘤细胞中血管生长的重要因子之一。肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system，RAS)是体内调节水钠潴留的重要系统，是人体内重要的体液调节系统。最近的研究表明：肾素血管紧张素在多种肿瘤疾病进展过程中发挥着重要作用，血管紧张素与肿瘤疾病的进展具有高度相关性[1～3]。许多肿瘤细胞组织中VEGF高表达，癌细胞能自身合成VEGF；而RAS与VEGF表达呈正相关[4，5]。本文探讨血管紧张素Ⅱ受体抑制剂厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用和对VEGF因子表达的影响，为临床抗肿瘤靶向治疗提供理论参考。