Eales病患者血清中T淋巴细胞因子的检测及临床分析△

赵娜　陆勤康　魏世辉　王惠云　童奇湖　赖晓明



·临床研究·

Eales病患者血清中T淋巴细胞因子的检测及临床分析△

赵娜陆勤康魏世辉＊王惠云童奇湖赖晓明

【摘要】目的检测Eales病患者血清中的T淋巴细胞(T细胞)因子。方法采用Luminex技术分别检测Eales病首发病例组、治愈病例组和健康对照组血清中辅助性T细胞1(TH1)亚群分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)和Th2细胞亚群分泌的白细胞介素4(IL-4)的浓度变化。结果TNF-α在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的浓度分别为(23.08±0.22)、(12.36±0.16)、(12.38±0.13) pg/mL；IFN-γ的浓度分别为(18.23±0.26)、(7.07±0.19)、(6.66±0.22)pg/mL。首发病例组和治愈病例组(P<0.001)，首发病例组和健康对照组(P<0.001)，治愈病例组和健康对照组(P=0.04)，各组比较差异均有统计学意义。IL-4在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的浓度分别为(4.18±0.19)、(4.16±0.13)、(4.15±0.12)pg/mL。首发病例组和治愈病例组(P=0.03)，首发病例组和健康对照组(P=0.01)，各组比较差异均有统计学意义；治愈病例组和健康对照组(P=0.79)差异无统计学意义。Th1和Th2细胞代表因子的比值IFN-γ/ IL-4在首发病例组、治愈病例组和健康对照组分别为4.26±0.11、1.70±0.08和1.49±0.06。首发病例组与治愈病例组(P<0.001)，首发病例组与健康对照组(P<0.001)，治愈病例组与健康对照组(P=0.02)，各组比较差异均有统计学意义。结论Eales病患者血清中T细胞因子的浓度均有不同程度升高，且Th1/Th2比值升高。可见Th1亚群分泌的细胞因子占优势，可以证明T细胞亚群的失衡参与了Eales病的免疫机制。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：99-102)

【关键词】Eales病；免疫因子；Luminex

△基金项目：宁波市医学科技计划项目(2010A16)

作者单位：浙江省宁波市鄞州人民医院眼科中心(宁波大学医学院附属鄞州医院眼科中心)宁波315040；

＊中国人民解放军总医院眼科中心北京100853通讯作者：陆勤康(Email: 12556677@qq.com)

Eales病又称视网膜静脉周围炎(idiopathic retinal vasculitis)，是一种视网膜血管炎症性疾病，以血管的炎性渗出、玻璃体反复出血为主要特征，多为双眼先后发病。在青年男性中患病率高，致盲率高[1]。该病的病因及发病机制尚无明确定论，多数学者认为Eales病是由多种病因、多种系统参与引起的眼部疾病[2]。近年来已陆续有报道[3]提示，自身免疫机制存在于Eales病的发病机制中；而在1型糖尿病[4]、系统性红斑狼疮[5]、类风湿关节炎[6]等自身免疫性疾病中，已经证实T淋巴细胞(T细胞)因子的变化参与了其免疫机制。现为探讨Eales病的免疫机制中是否也存在T细胞因子的变化，我们对Eales病患者血清中T细胞因子进行检测并做临床分析，为揭示Eales病的发病机制提供理论依据。

1资料与方法

1.1研究对象的选择及分组本研究选择Eales病首发病例33例，设为首发病例组，均为男性；发病年龄21～39岁，平均(30.04±9.23)岁。临床有玻璃体出血23例、未出血10例。治愈病例33例，设为治愈病例组，均为男性；发病年龄20～39岁，平均(29.87±9.08)岁。临床有玻璃体出血20例、未出血13例。同时选择健康献血者33例作为健康对照组，年龄为20～40岁，既往健康，无自身免疫性疾病及遗传病等病史，全身及眼部检查正常。无特殊病史，眼科检查无异常。

本研究的诊断标准在Biswas等[7]提出的Eales病疑似病例诊断标准基础上，通过眼底表现、荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography, FFA)2项检查显示血管旁白鞘和静脉管壁着染均阳性者，即可诊断为视网膜静脉周围炎(图1A、B)。治愈病例组患者通过口服药物如皮质类固醇激素、激光光凝术和玻璃体-视网膜手术等方法治疗，以玻璃体积血吸收或手术清除，无玻璃体视网膜增殖性改变；视网膜周边可见静脉白鞘或硬化但无视网膜水肿及出血；FFA无静脉渗漏作为Eales病临床治愈标准(图1C、D)。

1.2方法受试者于晨起空腹抽取静脉血,按试剂盒要求分离血浆,-30 ℃冰箱保存待测。试剂盒购自美国R&D Systems公司，采用LuminexTM100-液相芯片分析平台(美国Luminex公司研制)同时对肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor α，TNF-α)、干扰素γ(interferon γ,IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)进行检测。应用MasterPlexTMQT多元数据分析软件绘制标准曲线，直接计算出同一孔中TNF-α、IFN-γ、IL-4的含量。

图1.眼底照相及FFA
A. Eales病患者首发病例眼底照相显示黄斑星芒状渗出，静脉可见白色炎症渗出，颞侧可见血管白鞘，视网膜点片状出血；B. Eales病患者眼底FFA显示，颞下象限视网膜新生血管膜扇形强荧光，血管壁荧光素渗漏，周边部毛细血管无灌注，大片出血灶遮挡背景荧光；C. Eales病患者治愈病例眼底照相显示颞侧可见视网膜激光斑，血管白鞘，无玻璃体出血、视网膜水肿及出血；D. Eales病患者治愈病例眼底FFA显示，眼底大致正常，无视网膜水肿及出血，无静脉壁着染及渗漏

1.3统计学处理应用SPSS18.0分析软件One-Way ANOVA进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义，所得数据以均数±标准差表示。

2结果

Eales病患者Th1型细胞因子TNF-α在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的浓度含量分别为(23.08±0.22)、(12.36±0.16)、(12.38±0.13) pg/mL。首发病例组和治愈病例组(P<0.001)，首发病例组和健康对照组(P<0.001)，治愈病例组和健康对照组(P=0.03)，各组比较差异均有统计学意义。

IFN-γ在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的浓度含量分别为(18.23±0.26)、(7.07±0.19)、(6.66±0.22)pg/mL。首发病例组和治愈病例组(P<0.001)，首发病例组和健康对照组(P<0.001)，治愈病例组和健康对照组(P=0.04)，各组比较差异均有统计学意义。

Th2细胞因子IL-4在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的浓度含量分别为 (4.18±0.19)、(4.16±0.13)、(4.15±0.12)pg/mL。首发病例组和治愈病例组(P=0.03)，首发病例组和健康对照组(P=0.01)，差异均有统计学意义；治愈病例组和健康对照组(P=0.79)，差异无统计学意义。

Th1和Th2细胞因子的比值IFN-γ/ IL-4在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的比值分别为4.26±0.11、1.70±0. 08和1.49±0.06。首发病例组与治愈病例组(P<0.001)，首发病例组与健康对照组(P<0.001)，治愈病例组与健康对照组(P=0.02)，各组差异均有统计学意义(表1)。

表1　3组Th1、Th2细胞所分泌的细胞因子情况(pg/mL)

3讨论

Th细胞根据功能不同可分为Th1和Th2细胞2个亚群，两者通过分泌的不同细胞因子间的相互制约，处于动态平衡状态，维持着机体免疫系统的正常功能，Th1/Th2细胞平衡变化是体内炎症反应与抗炎反应及免疫平衡变化的基础[8]。

本实验采用较先进的Luminex实验技术，通过 LuminexTM100-液相芯片分析平台，可同时对Eales病患者治疗前、后血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4进行检测， 再应用MasterPlexTMQT多元数据分析软件绘制标准曲线，直接计算出同一孔中IFN-γ、TNF-α、IL-4的含量。Luminex实验技术是在流式细胞术、酶联免疫吸附试验和芯片的基础上开发的新一代研究平台，是一套多功能的液相反应检测系统。目前国内应用少见。

实验检测结果显示，Eales病患者血清中TNF-α的浓度升高。TNF-α是一种由单核-巨噬细胞和血管内皮细胞等分泌的调节机体免疫和代谢过程的多功能细胞因子，过量的TNF-α可引起炎症损伤和免疫抑制效应[9]。TNF-α在首发病例组患者血清中的浓度升高可能是因为TNF-α作为炎症介质，使局部发生炎症反应及周围组织白细胞积聚，血管通透性增加，纤维蛋白沉积，微血栓形成，并刺激中性粒细胞附着血管壁，释放溶酶体等物质，导致局部血管内皮细胞出现损伤及脱落，形态发生显著变化，以及大量炎性细胞浸润，造成血管炎的发生，甚至出血[10]。另外，微血管病变是Eales病的特征性表现，TNF-α导致内皮细胞的损伤可能是引起微血管病变的主要因素。

另外，Eales病患者血清中IFN-γ浓度升高。IFN-γ为Ⅱ型干扰素，主要由活化的T细胞和自然杀伤细胞分泌，是典型的 Th1型炎性细胞因子，具有多种抗肿瘤和免疫调节作用，包括激活巨噬细胞和增强T细胞介导的细胞免疫[11]。Eales病患者首发病例组的血清中IFN-γ浓度明显升高，原因可能是IFN-γ可以显著上调人类主要组织相容性复合体(MHC)-II在单核巨噬细胞的表达，促进自身抗原的呈递，增强T细胞对自身抗原的反应[12]。此外， IFN-γ还可以促进细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)的表达。ICAM-1是内皮损伤的一个重要指标[13-15]。IFN-γ还具有明显的溶细胞效应，其导致内皮细胞损伤可能是发生微血管病变的主要因素。

Th2细胞因子IL-4在首发病例组、治愈病例组和健康对照组的浓度含量分别为 (4.18±0.19)、(4.16±0.13)、(4.15±0.12)pg/mL。首发病例组和治愈病例组(P=0.03)，首发病例组和健康对照组(P=0.01)，差异均有统计学意义(P<0.05)。治愈病例组和健康对照组(P=0.79)，差异无统计学意义(P>0.05)。IL-4是B细胞增生和分化的重要因子，可减弱单核细胞的吞噬作用，抑制炎性因子IFN-γ、TNF和IL-6 的分泌，因而可控制炎症的进展，抑制细胞免疫的作用，与IFN-γ的作用相反。IL-4控制了由Th1致炎细胞因子造成的组织损伤。有报道[16]对IL-4抑制免疫应答机制作了阐释，IL-4作用于树突细胞(dendritic cell, DC)的基部而减弱溶细胞性T细胞的应答。IL-4阻止抗原刺激白细胞毒性前体物质促DC分化的过程，从而影响DC 对CD8+T 细胞的活化。本实验结果表明，患者血液中IL-4的浓度比对照组升高，可见由于Th1中的炎性因子IFN-γ和TNF-α浓度显著升高，刺激Th2细胞中的抗炎性、抑制免疫应答因子IL-4浓度升高，以达到控制炎症和调节免疫的目的。IL-4在Eales病的发生中起着保护免疫反应的作用[17]。

正常情况下，Th1和Th2细胞亚群两者以相互拮抗和自身促进的方式，形成复杂有序的细胞因子网络，分别行使各自不同的生理功能，调节正常的免疫应答。但是在某些疾病状态下，淋巴细胞平衡失调，产生细胞因子种类和数量发生变化，导致细胞免疫及体液免疫功能紊乱，引起异常免疫应答。由于Th1/ Th2细胞比值较Th1细胞或Th2细胞更能体现患者体内Th1细胞与Th2细胞的平衡情况，多数研究以高表达IFN-γ和IL-4分别代表Th1细胞和Th2细胞进行比值分析间接反映机体免疫调节功能的情况[18]。本研究发现，Eales病患者血清中T细胞亚群存在明显失衡，Th1细胞占优势，分泌模式朝Th1细胞偏移, 产生了所谓“免疫漂移”现象。Th1炎症性细胞因子增加，而抑制细胞免疫的Th2细胞因子虽然也有小幅度提高，但并没有起到控制炎症和调节免疫的保护作用，使血液中Th1细胞因子相对增多明显，结果进一步导致Eales病细胞免疫及体液免疫功能紊乱，引起异常免疫应答。因此Th1/Th2细胞失衡在Eales病变中起着一定的作用。Th1/Th2细胞比例失衡通过细胞间的接触，极大地促进了巨噬细胞和DC的活性和细胞因子的分泌，使得炎症反应持续存在，导致Eales病的发生。在研究中，我们还发现，治愈病例组和健康对照组间也存在小幅度的Th1/Th2细胞比例失衡，说明虽然Eales病患者的眼部并发症得到完全治愈，但是体内的T淋巴细胞亚群仍存在失衡。这可能也是Eales病容易复发的潜在因素。

通过以上的实验研究分析，我们认为Eales病患者血清中存在因T细胞亚群失衡引起的免疫功能紊乱现象。本研究为更深入探讨Eales病的免疫机制提供了理论依据，为Eales病的预防、监测和治疗提供了新思路，具有一定的临床实用价值。然而本研究只分析了患病组、治愈组、健康对照组间T细胞因子的变化，而治疗效果是否会对T细胞因子产生影响尚不明确。今后将采用免疫荧光法和酶联免疫吸附试验进行验证，进一步探讨T细胞因子在Eales病治疗指导中的作用。

参 考 文 献

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(本文编辑诸静英)

Detection of serum T lymphocytes cytokines of patients with Eales disease and its clinical significance

ZHAONa,LUQin-kang,WEIShi-hui＊,WANGHui-yun,TONGQi-hu,LAIXiao-ming.

OphthalmologyCenter,YinzhouPeople’sHospitalofNingboCity,YinzhouHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315040,China

【Abstract】ObjectiveTo detect the serum T lymphocytes cytokine of patients with Eales disease. MethodsLuminex technique was used to detect the concentration changes of tumour necrosis factor α(TNF-α) and interferon γ (IFN-γ) secreted by helper T cells 1 (Th1) subset and interleukin 4 (IL-4) secreted by Th2 subset in the serum of patients with Eales disease untreated group, cured group and healthy control group.ResultsThe concentrations of TNF-α in untreated group, cured group and healthy control group were (23.08±0.22),(12.36±0.16), (12.38±0.13) pg/mL, respectively; the concentrations of IFN-γ in untreated group, cured group and healthy control group were (18.23±0.26), (7.07±0. 19), (6.66±0.22) pg/mL, respectively. The differences of the concentration of TNF-α and IFN-γ between untreated group and cured group (P<0.001), untreated group and healthy control group (P<0.001), cured group and healthy control group (P=0.04), were statistically significant. The concentrations of IL-4 in untreated group, cured group and healthy control group were (4.18±0.19), (4.16±0.13), (4.15±0.12), respectively. The differences of the concentration of IL-4 between untreated group and cured group (P=0.03), untreated group and healthy control group (P=0.01) were statistically significant. While the difference was not statistically significant between cured group and healthy control group (P=0.79). The ratios of representative factors (IFN-γ/ IL-4) of Th1 and Th2 in untreated group, cured group and healthy control group were 4.26±0.11, 1.70±0. 08 and 1.49±0.06, respectively. The differences of the ratio between untreated group and cured group (P<0.001), untreated group and healthy control group (P<0.001), cured group and healthy control group (P=0.02) were statistically significant. ConclusionsConcentrations of T lymphocytes cytokines in the serum of Eales disease of patients are increased at diferent degrees, and the Th1/Th2 ratio is also increased, which indicates the domination of cytokines secreted by Th1 subset. The imbalance of T lymphocyte subsets participates in the immunological mechanism of Eales disease.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:99-102)

【Key words】Eales disease; Immune factors; Luminex

(收稿日期2015-04-29)

Corresponding author：LU Qin-kang, Email: 12556677@qq.com

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.02.009