羧甲基-β-1,3-葡聚糖对人B淋巴母细胞的辐射防护作用

马斌博王转子魏 巍党秉荣李文建

1（兰州大学药学院 兰州 730000）2（中国科学院近代物理研究所 兰州 730000）



羧甲基-β-1,3-葡聚糖对人B淋巴母细胞的辐射防护作用

马斌博1,2王转子2魏 巍2党秉荣2李文建1,2

1（兰州大学药学院 兰州 730000）
2（中国科学院近代物理研究所 兰州 730000）

摘要利用X射线辐照经羧甲基-β-1,3-葡聚糖预处理的人B淋巴母细胞(Human B lymphoblasts, HMy2.CIR)，探究羧甲基-β-1,3-葡聚糖对辐射损伤的防护作用。采用CCK-8法检测细胞存活率，并筛选出最佳给药浓度和孵育时间(0.1 μg/mL, 72 h)；流式细胞仪检测羧甲基-β-1,3-葡聚糖对辐照后HMy2.CIR细胞凋亡的影响；微核实验检测羧甲基-β-1,3-葡聚糖对辐照后HMy2.CIR细胞微核形成的影响；彗星实验检测对DNA损伤程度和修复的影响。结果表明，羧甲基-β-1,3-葡聚糖对HMy2.CIR无细胞毒性并具有增殖促进作用；羧甲基-β-1,3-葡聚糖能够抑制辐射造成的凋亡率和微核率的增加，降低DNA损伤程度，加快损伤DNA的修复。羧甲基-β-1,3-葡聚糖对HMy2.CIR细胞辐射损伤有防护作用，其机制可能与抑制辐射诱导的细胞凋亡和DNA损伤有关。

关键词羧甲基-β-1,3-葡聚糖，人B淋巴母细胞，X射线辐射，辐射防护效应

基金资助：国家自然科学基金项目(11575259)资助

第一作者：马斌博，男，1987年10月出生，2013年毕业于西南科技大学生命科学与工程学院，现为兰州大学在读硕士研究生，专业为辐射防护药物

Supported by the National Natural Science Foundation of China (11575259)

First author: MA Binbo (male) was born in October 1987, and received his bachelor degree from Southwest University of Science and Technology in 2013. Now he is a master candidate at Lanzhou University, majoring in radioprotector

Received 12 October 2015, accepted 18 January 2016

放射治疗是一种有效的肿瘤治疗手段，但治疗时射线不能针对特定的肿瘤组织，对肿瘤组织周围的正常组织也会造成不必要的辐射损伤[1-2]。不同种类的多糖，例如葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等具有抗遗传毒性、抗氧化、抗辐射、抗感染和抗肿瘤活性，一直被用于增强免疫能力和免疫调节[3]。

β-葡聚糖具有预防癌症、保肝、降血脂和恢复造血等对人体有益的功能[4-9]；β-葡聚糖根据溶解性分为可溶性和不溶性两类，酵母β-葡聚糖是属于不溶性的，其在科学研究、医药、食品和化妆品等相关领域的应用受到了极大的制约。本研究所选用的羧甲基-β-1,3-葡聚糖(Carboxymethy-β-1,3-glucan, CMG)由酿酒酵母中的β-葡聚糖通过羧甲基化制备得到。

本文旨在通过羧甲基化对不溶性β-葡聚糖进行改性，从而达到增溶的目的。化学修饰不会破坏β-葡聚糖的三股螺旋构象[10]，因此修饰后的葡聚糖仍具有免疫增强、抗氧化、抗辐射和抗肿瘤等活性，而且水溶性明显增加，便于使用，同时拓宽了酵母β-葡聚糖的应用领域[11-12]。不溶性酵母β-葡聚糖的羧甲基化衍生物对细胞的辐射防护效应还未见报道。本研究采用人B淋巴母细胞(HMy2.CIR)，研究了羧甲基-β-1,3-葡聚糖的细胞毒性效应及其对细胞辐射损伤的防护效应。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

正常人B淋巴母细胞购自中科院上海细胞库，由中科院近代物理研究所生物物理室培养和保藏。用含10%胎牛血清的IMDM(Iscove’s modified Dulbecco medium)培养液(Gibco)（加青霉素和链霉素各100 U/mL）培养，呈悬浮生长，在CO2恒温培养箱中培养，用对数生长期细胞进行实验。

1.2 药品和仪器

1.2.1 主要药品

IMDM培养基(Gibco)、胎牛血清和磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline, PBS)(HyClone)、细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)（日本同仁化学），细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit)（联科生物技术有限公司），DMSO和Triton X-100（上海生工生物工程有限公司），低熔点琼脂糖凝胶(LMPA)、正常熔点琼脂糖凝胶(NMPA)、溴化乙锭(EB)和吖淀橙(AO)(SIGMA)、羧甲基-β-1,3-葡聚糖均由本实验室制备。

1.2.2 仪器

RX-650 X射线仪（FAXITRON，美国），流式细胞仪(Becton Dickinsonand)，AR20ro型酶标仪（ANSOSROSIS，瑞典），BX53+DP72光学荧光成像显微系统（OLYMPUS，日本）。

1.3 实验分组及细胞照射

取对数生长期HMy2.CIR，实验分为以下4组：对照组(Control)、加药组(CMG)、X射线照射组(IR)以及联合组(IR+CMG)。IR和IR+CMG进行1.5 Gy 的X射线照射，剂量率为1 Gy/min。

1.4 细胞毒性及增殖实验

制备适宜浓度的HMy2.CIR单细胞悬液，向96孔板中每孔接种3000个细胞。实验分为：空白组（不含细胞和药物），对照组（含细胞），实验组（含细胞和药物）实验设置6个不同药物浓度，各处理组6个复孔。向各处理组细胞分别给予不同浓度的CMG（终浓度分别为0、0.01、0.1、1、100、200、400 μg/mL），孵育24、48、72 h后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液。将加入CCK-8的96孔板在37 ºC下继续反应2 h，然后测定各孔在450 nm的吸光值(A)以计算细胞存活率(R，%)，重复3 次，求平均值。

1.5 细胞凋亡实验

实验分组按1.3节进行。接种适宜浓度的HMy2.CIR的单细胞悬液于6 孔板中。CMG和IR+CMG的细胞用0.1 μg/mL药物预处理72 h，预处理后进行X射线照射至吸收剂量为1.5 Gy，照射结束后各不同处理组细胞立即更换新鲜培养液，继续培养24 h后收集细胞，PBS洗涤细胞两次，加入500 μL Annexin V Binding Buffer 悬浮细胞，再加入10 μL的Anexin V-FITC 混匀后，加5 μL的PI，混匀；反应15 min，整个染色过程需避光在室温条件下进行，最后流式上样检测早凋和晚凋率。

1.6 微核实验

实验分组与处理分别按1.3节和1.5节进行。IR组和IR+CMG经X射线照射至吸收剂量为1.5 Gy，照射结束后给各不同处理组细胞更换新鲜培养液，分别收集24、48、72 h后3个时间点的微核，借鉴参照文献的微核实验方法[13]，并略作改进，到时间点后，收集各不同处理组的细胞，先用低渗液（浓度0.075 mmol/L的KCl）进行低渗，然后用固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）进行固定，最后滴片，晾干，用50 μg/mL吖啶橙(AO)染色后，将染好的片子置于荧光显微镜拍照、观察，统计微核。

当有多个微核出现在1个细胞中时，只统计为1个微核细胞。各不同处理组均观察两张片子，每张片子上统计细胞染色清晰并且结构完整的1000个细胞，统计出现微核的细胞数，计算微核率。

1.7 彗星实验

实验分组与处理分别按1.3节和1.5节进行。IR组和IR+CMG经X射线照射至吸收剂量为1.5 Gy后分别于0、10 min收集各不同处理组细胞进行彗星实验，操作步骤借鉴文献[14]，并略做改变。

1.7.1 制片

第一层凝胶制备：加热溶解正常熔点琼脂糖(Normal melting agarose, NMA)于PBS中，使其浓度为1%，冷却后在磨砂载玻片上滴加NMA(100～200 μL)，将干净的盖玻片立即盖在滴好的NMA上，使凝胶铺平整，然后在4 ºC下放置15 min使其凝固。第二层凝胶的制备：加热溶解低熔点琼脂糖(Low metling agarose, LMA)于PBS中，使其浓度为1%，冷却到37 ºC，移去第一层胶上的盖玻片，取制备好的适宜浓度的单细胞悬液80、420 μL的LMA 混匀，迅速将100 μL该含细胞的混合液滴加到已经凝固的第一层胶上，平整和凝固凝胶操作与上一步相同。第三层凝胶的制备：取下第二层胶上的盖玻片，滴加37 ºC恒温LMA适量(50～100 μL)于第二层已经凝固的凝胶上，平整和凝固凝胶操作与上一步相同。

1.7.2 细胞裂解

将新鲜配制的并事先预冷的，pH值为10.0的碱性裂解液缓慢地加到铺平放置好凝胶的磨砂载玻片的平皿中，4 ºC下裂解2 h。取出载玻片，双蒸水漂洗2次。

1.7.3 DNA碱解旋

将载玻片放进已经加入现配置电泳缓冲液的电泳槽中，使液体高过胶面0.25cm左右，在室温避光条件下静置20 min。 细胞电泳：稳压20 V，电流295～300 mA，遮光电泳20 min。

1.7.4 中和与染色

将电泳完的载玻片轻轻从电泳槽中取出，转移到平皿中，先用双蒸水漂洗2次，再用pH为7.5，浓度为0.4 mol/L的Tris∙HCl缓冲液漂洗3次，漂洗结束后用PBS缓慢冲洗胶面，然后用滤纸吸干胶面的水分，自然晾干。向各不同处理组的载玻片上滴加2～3滴10 μg/mL的EB进行染色，避光反应5 min。

1.7.5 观察、拍照和分析

各不同处理组计数两张玻片，每张计数50个细胞，共100个。图片拍照保存。

1.8 实验数据处理

2 结果

2.1 CMG对细胞增殖的影响

图1为HMy2.CIR分别给予含0、0.01、0.1、1、100、200、400 μg/mL CMG的完全培养基孵育24、48、72 h后的存活率。各药物浓度及作用时间下均未表现出细胞毒性，但基本都表现出了对HMy2.CIR的增殖促进作用，从而确定了CMG对细胞是无毒、安全的。在浓度为0.1 μg/mL，孵育72 h时对HMy2.CIR的增殖的影响有显著性，所以后续实验选择用0.1 μg/mL，72 h作为预处理条件，研究细胞在接受X射线照射后，CMG是否会起到辐射防护的作用。

2.2 CMG对细胞凋亡的影响

正常的细胞磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)处于细胞膜内，而PS在凋亡发生的早期会翻转到膜外，此时细胞膜的结构仍具有完整性，细胞只会被FITC标记的Annexin-V与外翻的PS结合，而不会与PI结合；到凋亡发生的晚期，细胞膜结构被破坏，两种染料可以同时与细胞结合。

对FITC/PI双染后各不同处理组细胞的早期凋亡和晚期凋亡率进行流式检测，结果如图2所示。CMG和Control相比，HMy2.CIR的早凋和晚凋亡率没有表现出差异性(p>0.05)，表明CMG不会诱导细胞凋亡的产生；IR和Control相比，早凋和晚凋比例均有所提高，并且表现出差异性(p<0.05)；IR+CMG与IR相比较，早凋和晚凋的比例均有所减少，并且表现出差异性(p<0.05)（图3）。

2.3 CMG对微核形成的影响

各不同处理组微核率随着收获时间的变化呈现先升高后降低的趋势，结果如图4所示。IR和Control相比，各时间点微核率均有升高(p<0.01)；IR+CMG与IR相比，各时间点的微核率均有降低(p<0.01)。由实验结果可知，CMG对细胞的预处理能够降低微核的形成。

2.4 CMG对DNA损伤修复的影响

图5为通过碱性单细胞凝胶电泳实验后拍摄的各处理组细胞的彗星图像。

彗星尾距实验结果如图6所示，细胞在经X射线照射后会发生DNA损伤，未修复和修复中的IR 和Control相比，尾距差异有显著性(p<0.01)；照射后零点进行彗星实验的未修复组中IR和IR+CMG相比，尾距有差异性(p<0.05)，表明由X射线照射造成的DNA损伤程度可由CMG预处理减轻；照射后给予10 min修复时间的IR和IR+CMG相比，尾距差异有显著性(p<0.01)，表明CMG预处理对DNA损伤修复也产生了一定促进作用。

3 讨论

放射治疗是一种治疗癌症的有效手段，但是放疗时对正常细胞的损伤和肿瘤细胞的放射抵抗性限制了放射治疗在癌症治疗中的应用。因此，对于放疗时能选择性地增加肿瘤放疗敏感性，同时能减轻正常组织受到辐射损伤的药物的研究，已成为放射治疗学领域关注的热点。

β-葡聚糖可以作为抗癌药物，但是它对正常的组织和细胞不产生毒性作用。本研究选择HMy2.CIR探究CMG生物活性，探究CMG是否能够减轻细胞遭受的辐射损伤程度。由CCK-8的实验结果可以看出，随着CMG浓度(0.01～400 μg/mL)的增加和孵育时间(24～72 h)的增加都没有表现出对细胞的毒性作用和增殖抑制作用。

诸如电离辐射等外界刺激能够使细胞DNA受到不同类型的损伤，损伤的类型包括DNA单键(SSBs)、双键的断裂(DSBs)等，受到损伤的细胞自身有修复这些损伤以及阻止损伤所致的突变损伤遗传进入下一代的能力[15]。细胞受到的损伤需要有足够的时间来修复，这样就会出现周期阻滞现象[16-17]，使其停滞在细胞周期的某一个阶段（例如G2/M期），如果损伤的程度超过了细胞自身的修复能力，则细胞会启动凋亡的发生，清除无法进行修复的细胞。同时活性氧在电离辐射对细胞造成的氧化损伤中也发挥着至关重要的作用，通常情况下机体或细胞内的活性氧处于动态平衡[18-19]，由于电离辐射能够诱导活性氧增加，从而使细胞内活性氧生成和清除的平衡被打破，使细胞受到氧化损伤。从早凋和晚凋的实验结果可以看出，IR+CMG与IR相比，早凋和晚凋率均有所降低，其原因可能是CMG能够促进细胞清除由于电离辐射产生的多余的自由基，减少活性氧诱导的凋亡发生。

根据抵抗诱变作用机理的不同，可以把抗诱变剂进行以下两种分类：灭致突变物(Desmutagen)和生物抗致突变物(Bio-antimutagens)。灭致突变物通过直接作用于诱变剂，阻断其对机体或者细胞的作用；生物抗致突变物是在损伤发生以后，主要通过调节DNA的复制减轻致突变物对机体或者细胞的作用[20]，从而降低致突变物的遗传毒性。CMG属于生物抗致突变物，其DNA抗辐射损伤作用可能通过与细胞上受体结合，从而激活一些信号通路有关，例如C型凝集素受体(Dectin-1)和Toll样受体(TLR)等；也可能与CMG的自由基清除作用有关。彗星实验结果可知，对于X射线造成的HMy2.CIR SSBs损伤，CMG的预处理能够降低这种损伤的程度，这跟早凋和晚凋率变化的结果也是一致的。

如彗星实验结果所示，CMG明显减轻了辐射所造成的DNA损伤，并提升了受损伤DNA的修复能力。CMG产生辐射防护作用的机理或许跟药物和HMy2.CIR细胞膜表面的某种特定受体的结合有关，从而介导了特定的细胞修复的信号通路的激活。研究证明，β-葡聚糖的受体有Dectin-1、选择性清道夫受体和补体受体3(CR3, CD11b/CD8)等[21]，其中的Dectin-1作为具有C型凝集素样结构域的受体，β-葡聚糖结构中的一些特定糖基可以被其识别。同时研究证明，在人的大多数组织中该受体的mRNA均有表达。巨噬细胞上的Dectin-1和TLR受体能够同时识别酵母β-葡聚糖，两种受体共同介导酵母多糖的炎症反应，并且在炎症反应发生的过程中呈现协同作用，Dectin-1能够增强TLR介导NF-κB信号通路激活所产生的炎性细胞因子[22]。因此，CMG的辐射防护作用可能与Dectin-1和TLR受体结合，并激活NF-κB的信号转导有关。

本研究证明CMG成为辐射防护药物的潜在可能性，同时对不溶性β-葡聚糖的开发利用有重要意义。但对与CMG所结合的细胞受体或激活的细胞信号通路的研究结果尚未见相关报道。因此，对于CMG确切的作用机理还需进行深入探究。

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Protection effects of carboxymethyl-β-1,3-glucan on human B lymphoblasts’ injury induced by radiation

MA Binbo1,2WANG Zhuanzi2WEI Wei2DANG Bingrong2LI Wenjian1,21(School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)2(Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACTThe aim is to investigate radiation protection effect induced by carboxymethyl-β-1,3-glucan on Human B lymphoblasts(HMy2.CIR). The survival rate of carboxymethyl-β-1,3-glucan on HMy2.CIR was tested by CCK-8 assay at concentrations of 0, 0.01, 0.1, 1, 100, 200 and 400 μg/mL, respectively. The flow cytometry was used to measure the apoptosis rate. Micronucleus rate was assessed by the in vitro micronucleus test. DNA strand breaks were assessed by the comet assay. The results showed that treatment with carboxymethyl-β-1,3-glucan was not cytotoxic. Pre-treatment with carboxymethyl-β-1,3-glucan at concentration of 0.1 μg/mL for 72 h protected HMy2.CIR cells against radiation, as indicated by increased surviving fraction, reduced apoptosis, reduced micronucleus rate and fewer DNA strand breaks. The carboxymethyl-β-1,3-glucan has radiation protection effect onbook=59,ebook=28HMy2.CIR cells, which may be related to inhibition of apoptosis and DNA damage after radiation.

KEYWORDSCarboxymethy-β-1,3-glucan, Human B lymphoblasts, X-ray radiation, Radiation protection effect CLC R979.6, TL71

Corresponding author:Ph.D. LI Wenjian, professor, E-mail: wjli@impcas.ac.cn

收稿日期：初稿2015-10-12；修回2016-01-18

通讯作者：李文建，博士，研究员，E-mail: wjli@impcas.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020205

中图分类号R979.6，TL71