叶酸与八聚精氨酸双修饰脂质体的制备及其功效观察

金亚香，沈玉杰，赵毅，房学东(吉林大学中日联谊医院，长春 30033； 长春职业技术学院)



叶酸与八聚精氨酸双修饰脂质体的制备及其功效观察

金亚香1，沈玉杰1，赵毅2，房学东1(1吉林大学中日联谊医院，长春 130033；2 长春职业技术学院)

摘要：目的制备叶酸与穿膜肽八聚精氨酸(R8)双修饰的脂质体，并观察其功效。方法采用注入法制备叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体(FA-R8-LPs)，采用激光粒度分析仪对脂质体粒径和电位进行测定，采用琼脂糖凝胶电泳方法考察脂质体与VEGF siRNA的结合度，分别采用流式细胞计数法、激光共聚焦显微镜观察及Western blotting法观察载有VEGF siRNA脂质体对口腔癌KB细胞的抗肿瘤效果。结果叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体粒径为(112.5±3.7)nm，电位为(3.23±0.88)mV。FA-R8-LPs已基本完全与VEGF siRNA结合(FA-R8-LPs-siRNA)。FA-R8-LPs-siRNA对KB细胞的抑制率为44.5%，平均荧光强度值是未修饰脂质体的5倍左右。FA-R8-LPs与未修饰的脂质体相比明显提高了转染效率。结论成功制备了叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体，该脂质体能增强VEGF siRNA的抗肿瘤效果。

关键词：叶酸；穿膜肽；八聚精氨酸；脂质体

目前，核酸类药物是治疗恶性肿瘤的有效手段，但其具有容易被核酸酶降解、与细胞膜相互排斥、跨膜能力弱等特点[1～3]，高效率、低成本、低毒的药物载体是解决以上问题的关键。细胞穿膜肽又称蛋白转导域，具有携带比自身大100倍的物质穿透细胞膜进入细胞的能力。八聚精氨酸(R8)是由8个精氨酸组成的穿膜肽，能够穿过与之相接触的任何细胞的细胞膜，具有高效的穿膜作用，能够应用于核酸药物的传递过程[4,5]。叶酸是一种水溶性维生素，能特异性结合叶酸受体，是公认的对于肿瘤细胞具有靶向性的配体[6～8]，将叶酸与R8两种配体结合，制备双修饰的脂质体，装载核酸类药物，以增强核酸类药物的抗肿瘤效果鲜有报道。本研究将叶酸和穿膜肽R8连接到脂质体的表面，制备双修饰的脂质体，并观察其功效。

1材料与方法

1.1仪器与试剂BP221S型电子天平(德国赛多利斯)；Mastersizer 2000型激光粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；710 LSMNLO型激光共聚焦显微镜(德国卡尔·蔡司公司股份公司)；EPICS XL型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；Synergy4型多功能酶标仪(美国BioTek公司)。R8 peptide(Cys-RRRRRRRR，成都凯捷生物科技有限公司)；血管内皮生长因子(VEGF)siRNA和5′-Cy3-VEGF siRNA(百奥迈科有效公司)；FA-PEG2000-DSPE(美国nanocs公司)；蛋黄卵磷脂(EPC，广州汉方有限公司)；胆固醇(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2细胞KB细胞为人口腔表皮癌细胞株，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，并加入100 μg/mL、链霉素和100 U/mL青霉素，于37 ℃孵箱中培养，采用0.25%胰蛋白酶传代消化。

1.3脂质体的制备分别精密称取EPC、胆固醇、FA-PEG2000-DSPE适量溶于氯仿乙醇溶液(体积比为5∶1)中，超声使之溶解。将上述磷脂溶液按照1∶9的体积比注入到Hepes缓冲液中，形成脂质体溶液，将穿膜肽R8与磷脂摩尔比为3∶17的比例加入到上述脂质体溶液中，制备叶酸与R8双修饰的脂质体(FA-R8-LPs)。按照同样方法，分别制备R8修饰的脂质体(R8-LPs)、叶酸修饰的脂质体(FA-LPs)和空白无修饰脂质体(C-LPs)。为了获得载有VEGF siRNA的脂质体，首先将上述脂质体溶液过0.22 μm的滤膜除菌，将VEGF siRNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，将siRNA与脂质体溶液在无菌条件下混合均匀，使得siRNA的终浓度为0.5 mmol/L，将上述载药脂质体超声10 s，备用。分别取载有VEGF siRNA的上述脂质体100 μL，用超纯水稀释至1 mL，采用激光粒度分析仪对粒径和电位进行测定，每个样品平行测定3次。采用琼脂糖凝胶电泳方法考察脂质体与siRNA的结合度。首先制备琼脂糖凝胶，称取2 g琼脂糖溶于100 mL TAE缓冲液中，加热后冷却，保证没有气泡，加入10 μL溴化乙锭溶液，轻摇使其混匀，倒入电泳胶槽，待冷却后备用。制备脂质体与siRNA溶液，用DEPC水将各样品总体积补充到10 μL，每个样品加入2 μL上样缓冲液，加入上样槽中，保持电压在100 mV运行20 min。最后将琼脂糖胶放于紫外凝胶成像系统中分析。

1.4载有VEGF siRNA脂质体对KB细胞的作用①脂质体载体毒性检测：将KB细胞计数后，稀释至1×105/mL浓度，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，每组设6个平行孔，置于CO2培养箱培养24 h。24 h后，弃培养液，PBS洗3遍，分别设立空白对照组和样品组，样品组中未载有siRNA的脂质体包括C-LPs、R8-LPs、FA-LPs和FA-R8-LPs，载有VEGF siRNA的脂质体组样品包括C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、FA-R8-LPs-siRNA，将上述样品分别加入96孔培养板，培养4 h。弃培养基，加入新鲜培养基，继续培养24 h后每孔加入10 μL的5 mg/mL的MTT溶液，置于CO2培养箱培养2 h，吸掉溶液后加入100 μL的DMSO，混匀后于540 nm处用酶标仪检测。②KB细胞对脂质体的摄取：a.采用流式细胞仪检测。将KB细胞用无叶酸培养基稀释至1×105/mL浓度，按每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，每组设3个平行孔，置于CO2培养箱培养24 h。24 h后制备不同的VEGF siRNA脂质体样品，其中VEGF siRNA采用5′-Cy3(红色荧光)进行标记。弃去培养液，PBS洗3遍，按顺序加入制备好的脂质体/siRNA体系样品，同时设计游离的siRNA(Naked siRNA)组，即未加入任何载体的siRNA组作为对照。分别置于CO2培养箱培养4 h后，消化细胞，离心后加入500 μL 4%的甲醛溶液固定，收集全部溶液置于流式细胞仪测定管中，样品可在4 ℃避光条件下保存，待用。b.采用激光共聚焦显微镜进行观察。转染过程同a，加入Naked siRNA和FA-R8-LPs-siRNA样品。转染结束后，吸出培养液，洗3次，加入4%的甲醛进行固定，洗去固定液。采用DAPI染色细胞核3 min，洗去染色液，再次用PBS洗3次，置于激光共聚焦显微镜下进行拍照。③KB细胞对脂质体的摄取机制：将KB细胞用无叶酸培养基稀释至1×105/mL浓度，按每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，培养24 h后加入不同的VEGF siRNA脂质体样品，同时加入蔗糖(网格蛋白介导的内吞作用抑制剂)、制霉菌素(细胞膜介导的的内吞作用)和细胞松弛素D(胞吞作用抑制剂)3种抑制剂与样品同时孵育4 h。采用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度，初步探索脂质体进入细胞的摄取机制[9]。④KB细胞VEGF蛋白检测：将KB细胞用无叶酸培养基稀释至1×105/mL浓度，按每孔2×105个细胞接种于6孔培养板中，培养24 h后加入不同的VEGF siRNA脂质体样品和无载体样品Naked siRNA，孵育4 h后加入胎牛血清，继续培养48 h后，采用细胞裂解液将KB细胞裂解，提取总蛋白，定量蛋白后，采用SDS电泳对蛋白进行分离，转膜后以GAPDH为内标，分别对GAPDH和VEGF蛋白进行一抗、二抗孵育，显影后观察蛋白下调效果。

2结果

FA-R8-LPs、R8-LPs、FA-LPs和C-LPs脂质体粒径和电位测定结果见表1。与Naked siRNA相比，4种脂质体均与siRNA呈现了不同程度的结合，其中FA-R8-LPs和R8-LPs与siRNA结合效果较好，已基本完全与siRNA结合，C-LPs和FA-LPs与siRNA的结合效果相对较差，siRNA的亮度较明显。

表1　4种脂质体粒径和电位比较±s)

注：与C-LPs脂质体比较，*P<0.01。

MTT检测结果显示，与空白对照组相比，C-LPs、R8-LPs、FA-LPs和FA-R8-LPs各脂质体对KB细胞无明显毒性，细胞存活率分别为98.545%、96.334%、97.546%、96.387%。与空白对照组相比，C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、FA-R8-LPs-siRNA对肿瘤细胞的抑制率分别为11.446%、25.666%、27.453%、44.527%，后三者与空白对照组比较，P均<0.01。流式细胞仪检测结果显示，与空白对照组和Naked siRNA相比，C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA均有明显的荧光迁移，其中迁移程度由大到小分别为FA-R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA和C-LPs-siRNA。C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA的平均荧光强度值分别为4.533±0.802、8.467±1.050、11.467±1.504、20.400±2.326，高于空白对照组(0.367±0.058)和Naked siRNA组(2.500±0.854)，P均<0.01。激光共聚焦显微镜观察发现，FA-R8-LPs-siRNA较Naked siRNA将大量siRNA转染进入到KB细胞内，使得肿瘤细胞的荧光强度明显增强。

与无抑制剂相比，制霉菌素和细胞松弛素D处理的KB细胞荧光强度值未见明显变化，而蔗糖作为抑制剂显著降低了KB细胞的平均荧光强度，见表2。与空白对照组相比，Naked siRNA、C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA均对VEGF蛋白有一定的抑制效果(P均<0.01)，VEGF蛋白相对下调量分别为11.68%、23.69%、57.77%、54.10%、60.86%。

表2　3种抑制剂处理的KB细胞荧光强度比较±s)

注：与无抑制剂相比，*P<0.01。

3讨论

VEGF是最有效的促血管生长因子，对肿瘤新生血管形成及肿瘤生长和转移起重要作用[10～12]。以VEGF及其受体为靶点，抑制肿瘤的发生与发展是抗癌药物研究的热点。本研究制备了叶酸与穿膜肽R8双修饰的脂质体，同时对一种VEGF siRNA进行装载，对其功效进行了系统的评价，同时对转染机制进行了初步考察。希望通过该载体高效地将VEGF siRNA转染进入到肿瘤细胞，发生RNA干扰[13]现象，降低VEGF的表达，导致肿瘤细胞发生凋亡或死亡的现象，提高抗肿瘤效果。

首先，为了评价制备脂质体的性质是否适用于进入到肿瘤部位，对制备的几种脂质体进行粒径和电位进行评价，双修饰脂质体粒径为(112.5±3.7)nm，粒径有利于载体在肿瘤部位的富集，同时具有较强的正电荷，因此利于与带负电荷的siRNA结合，转染进入细胞，进而发挥抗肿瘤功效。脂质体与siRNA结合度考察结果显示，双修饰的脂质体能够较好地与siRNA结合，进而有利于进入肿瘤细胞，而叶酸单修饰的脂质体与siRNA的结合能力较弱，可能由于与siRNA产生了阴离子竞争。

MTT实验结果显示，双修饰后的脂质体载体能够较高效率地将siRNA转染进入肿瘤细胞，导致细胞出现凋亡或者死亡现象，肿瘤细胞生长抑制率明显上升，而未载药的脂质体无明显毒性，表明脂质体载体安全可靠。流式细胞仪检测、激光共聚焦显微镜观察KB细胞对脂质体的摄取实验中，双修饰的脂质体进入肿瘤细胞明显，直观地反映了制备的载体能够将VEGF siRNA装载进入肿瘤细胞，释放核酸药物，进而实现抗肿瘤效果。同时采用了Western blotting实验对肿瘤细胞的VEGF蛋白进行测定，发现采用双修饰脂质体装载siRNA对肿瘤细胞的VEGF蛋白起到明显下调效果，这也是导致MTT实验中细胞出现凋亡或死亡现象的主要原因。

为了对本研究制备的体系进入肿瘤细胞的过程进行探讨，进行了细胞内吞机制的初步研究，可初步判断，脂质体的摄取可能是通过网格蛋白介导的内吞作用。这也为今后对于该载体的进一步体内研究提供了一定的参考和依据。

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(收稿日期：2015-08-27)

中图分类号：R318

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)11-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.014

通信作者：房学东(E-mail: fangxdooo@sina.com)