纤维素酶辅助提取桑叶中叶蛋白的工艺

朱天明，陈泠伶，杨　潇，杨文宇，陈祥贵

(西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039)



·生物工程·

纤维素酶辅助提取桑叶中叶蛋白的工艺

朱天明，陈泠伶，杨潇，杨文宇，陈祥贵*

(西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

摘要：以桑叶为原料采用纤维素酶辅助提取叶蛋白。通过单因素实验分别考察固液比、加酶量、酶解时间对桑叶叶蛋白溶出量的影响。运用响应面分析方法，得到叶蛋白溶出量的二次多项式回归方程的预测模型，并预测和验证纤维素酶辅助提取桑叶叶蛋白最佳工艺条件为：加酶量为4%，提取时间为2 h，固液比 1∶38 (g/mL)。在此条件下，5 g桑叶叶蛋白溶出量为49.056 mg。

关键词：桑叶叶蛋白；纤维素酶；响应面法；工艺参数

叶蛋白(leaf protein concentration，LPC)是以绿色植物的叶为原料，经蛋白溶解，沉淀，干燥而制备的蛋白质浓缩物[1]。叶蛋白除了用于药用(抗氧化、心血管病、抗菌等)、保健食品、饲料外，也可用于植物生长营养调节剂等方面，也可用于洗涤用品、化妆用品等日用化工品，也可从叶蛋白中分离制得胡萝卜素、叶绿素、纯蛋白质等许多功能性物质[2-5]。叶蛋白来源广泛、营养丰富、不含动物胆固醇，具有防病治病，防衰老等多种生理功能，是一种具有高度开发价值的新型蛋白质资源。

桑叶是桑科属的树叶。现代医学系统的研究了桑叶的药用和保健价值[6]，桑叶也被卫生部确定为药食同源、可用于保健品的植物材料之一。桑叶氨基酸种类比较齐全，而且半必需氨基酸和必需氨基酸含量比较高，是一种优质的植物蛋白质资源[7]。传统上桑叶仅用于养蚕，由于桑蚕生产数量有限，而且具有一定的季节性，故探索桑叶其他方面的应用就更显紧迫。

目前对叶蛋白的研究对象大多集中在苜蓿，而对桑叶蛋白的提取研究鲜有报道。提取方法大多为加热絮凝法、酸法、碱法、有机溶剂法和发酵酸法等[2]，但目前各种方法提取的叶蛋白的蛋白质含量不高、溶解性较差。综合各种方法的优缺点，本文采用纤维素酶辅助提取法来进行桑叶中叶蛋白的提取。采用纤维素酶可以有效地破坏桑叶细胞壁结构，提高叶蛋白的提取率，且酶解条件温和，蛋白质变性程度小[8]。采用响应曲面法对工艺条件进行全面优化，不仅考察各单因素对实验的影响，而且考察了各因素交互作用对实验的影响[9]。本研究可为桑叶叶蛋白提取工艺的确定提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

桑叶，采自重庆开县三峡库区；纤维素酶(10k U/g)，艾科化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250，北京欣华绿源科技有限公司；牛血清蛋白，如吉生物科技；磷酸、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氢氧化钠等，成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2仪器

TDL-408低速离心机，星科科技公司；UV- 2600紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司； 恒温水浴锅GSr-2，北京医疗设备厂；K9840自动凯氏定氮仪，海伦仪器。

1.2实验方法

1.2.1纤维素酶辅助提取桑叶叶蛋白工艺流程

工艺流程：桑叶粉碎→过筛(40目)→加pH值为5.0的磷酸缓冲液(一定固液比)→加纤维素酶酶解提取→加热钝化酶(100 ℃，10 min)→离心分离→叶蛋白质提取液。

工艺要点：称取一定量的经粉碎的桑叶粉，按一定的固液比(g 桑叶粉/ml磷酸缓冲液)加入pH为5.0的磷酸缓冲液，加入一定量的纤维素酶(g 酶/g桑叶粉)，置于恒温水浴锅中搅拌提取一段时间，提取结束后，100 ℃灭酶5 min，离心分离，测定提取液中蛋白质含量。

1.2.2蛋白质的测定方法

按照GB 5009.5—2010食品中蛋白质的测定中的凯氏定氮法测定干桑叶中蛋白质的含量；考马斯亮蓝比色法[10]测定提取液中桑叶叶蛋白质的含量。

1.2.3单因素实验设计

本实验研究加酶量、固液比和酶解时间的不同水平对桑叶蛋白溶出量的影响。纤维素酶的最适pH值为5，最适温度为50 ℃[11]。

加酶量对叶蛋白溶出量的影响：按1.2.1节所述的方法，在酶解时间1.5 h，固液比1∶30条件下，分别取2%、3%、4%、5%、6%的加酶量和未加酶，测定蛋白质的溶出量。

固液比对叶蛋白溶出量的影响：按1.2.1节所述的方法，在加酶量4%的条件下纤维素酶解1.5 h，分别取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40的固液比，测定蛋白质的溶出量。

酶解时间对叶蛋白溶出量的影响：按1.2.1节所述的方法，在固液比1∶30，加酶量4%条件下，分别酶解0、1、1.5、2、2.5 h，测定蛋白质的溶出量。

1.2.4响应面优化

在单因素实验的基础上，确定各个因素的水平值范围，采用Box-Behnken设计实验，选取酶解时间、加酶量和液固比为自变量，桑叶蛋白的溶出量为因变量，优化纤维素酶辅助提取桑叶蛋白工艺的最佳参数。实验因素及因素水平表见表1。

表1　响应面分析法的因素与水平表

2结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1加酶量对叶蛋白溶出量的影响

由图1可知，加入纤维素酶后桑叶蛋白的溶出率显著增加，说明纤维素酶有破坏植物细胞壁的作用，破壁后细胞内的蛋白质更容易释放出来，利于叶蛋白的提取。当加酶量低于4%时，桑叶溶出的蛋白质质量随加酶量的增加而缓慢增加，当酶量超过4%时，桑叶溶出的蛋白质质量趋于平稳。综合考虑，选择4%的纤维素酶添加量为中心组合设计的中心点水平。

图1　加酶量对叶蛋白溶出量的影响

2.1.2固液比对叶蛋白溶出量的影响

由图2可以看出，随着固液比的增加，桑叶总溶出的蛋白质质量先增加后减少。在固液比较低时，料液黏度过大，纤维素酶与桑叶粉结合不充分，导致溶出的蛋白质较少。随着固液比的增加，在固液比为1∶30时，桑叶总溶出的蛋白质质量最多，但再增加固液比，则总溶出的蛋白质质量反而减少。这是因为固液比大，桑叶浓度减小，导致酶与桑叶碰撞概率降低，纤维素酶的作用效果降低，桑叶总溶出的蛋白质质量减少。综上所述，选择固液比1∶30为中心组合设计的中心点水平。

图2　固液比对叶蛋白溶出量的影响

2.1.3酶解时间对叶蛋白溶出量的影响

由图3可知，随着提取时间的增加，桑叶总溶出的叶蛋白量不断增加，当提取时间达到1.5 h时，5 g桑叶总溶出的叶蛋白量达到最大值，随后总溶出的叶蛋白量没有明显增加。综合考虑，选择提取时间1.5 h为中心组合设计的中心点水平。

图3　酶解时间对叶蛋白溶出量的影响

2.2响应面分析及验证

2.2.1响应面实验结果及方差分析

根据中心组合试验的设计原理，以液固比A、加酶量B、反应时间C为自变量，以5 g桑叶总溶出的叶蛋白质质量为响应值，设计响应面试验，试验方案及结果见表 2。试验 1—12 为分析实验原因的试验，试验 13—15 为 3个用来估计试验误差的试验。

表2　响应面试验方案及结果

对表2实验数据进行多元回归分析，建立响应变量(提取液固比A，加酶量B，提取时间C)与响应值(5g桑叶总溶出的蛋白量)之间的二次响应面回归模型如下：

Y=42303.42-1978.05A+321.24B+

3040.62C-1042.63AB-7091.34AC-368.09BC-

22253.54A2-7959.17B2+2761.02C2。

表3　回归方程显著性检验

2.2.2响应曲面分析及优化

用Design Expert 7.1.6软件根据回归方程进行回归分析，得到回归方程的响应面和等高线图 (图4—6)。等高线图如果为圆形，则表明交互作用不明显；如果为椭圆，则表明这 2个因素的交互作用明显[12]。

(a)

(b)

当提取时间为1.5 h时，液固比与加酶量2个因素之间的交互作用见图4。在液固比为30～40 mL/g，加酶量3%～4%的范围内，5 g桑叶总溶出的蛋白质质量随着液固比的增加和加酶量的增加而增加，但之后再增加液固比和加酶量，蛋白质溶出的量呈现下降的趋势。从等高线图可以看出：加酶量比液固比对蛋白溶出量的影响效果更微弱。

当加酶量为4%时，液固比和酶解时间2个因素之间的交互作用见图5，可见2因素的交互作用显著。从等高线图可以看出：酶解时间比液固比对蛋白溶出量的影响效果更微弱，表现为曲线较为陡峭。在液固比为30～40 mL/g-1时，提高液固比可以提高蛋白的溶出量。

(a)

(b)

当液固比为40 mL·g-1时，加酶量和酶解时间2个因素之间的交互作用见图6。可以看出：加酶量对桑叶蛋白溶出量的影响比酶解时间更大。当加酶量在4%左右时，桑叶蛋白的溶出量出现极大值，加酶量超过4%，桑叶蛋白溶出量呈下降趋势。

由 Design expert 7.1.6 trail 软件对试验模型进行典型性分析以得到纤维素酶法提取桑叶叶蛋白质的最佳提取条件，经分析可得，当液固比为37.97mL/g，酶解时间为2 h，加酶量为 4.01%，在提取温度为50 ℃，pH为5的条件下，能获得5 g桑叶经酶解后总溶出的蛋白质质量为49.03 mg。为验证该模型的可靠性，根据实验实际操作，将酶解工艺参数调整为：液固比为38 mL/g，酶解时间为2 h，加酶量为 4%。在此实验条件下平行验证3次，得到5 g桑叶经酶解后总溶出的平均蛋白质质量为49.056 mg。试验值与模型值较为吻合，可见该模型能较好地反映纤维素酶法提取桑叶叶蛋白质的条件。按照GB 5009.5—2010食品中蛋白质的测定中的凯氏定氮法测定干桑叶中蛋白质的质量分数为15.29%，用本实验优化的桑叶叶蛋白提取工艺所得的叶蛋白提取率为6.5 g/100g，比江洪波等[13]人优化的桑叶叶蛋白提取工艺所得的叶蛋白提取率4.42g/100g高，是一种优良的提取桑叶中叶蛋白的方法。

(a)

(b)

3结论

本实验在单因素实验的基础上，利用响应面法对纤维素酶辅助提取桑叶叶蛋白的工艺进行了优化，建立了二次多项回归模型，为今后植物蛋白的提取提供理论基础。结果表明，影响纤维素酶辅助提取桑叶叶蛋白的工艺因素依次为：加酶量<液固比<酶解时间，最佳工艺条件为：固液比 1∶38 (g/mL) ，酶解时间为2 h，加酶量为 4%，此时5 g桑叶经酶解后总溶出的蛋白质质量为49.056 mg。本实验为桑叶蛋白在食品、医药等领域的开发利用提供了依据。

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(编校：叶超)

Study on Cellulase Assisted Extraction Process of Leaf Protein fromMorusAlbaLeaves

ZHU Tianming,CHEN lingling,YANG Xiao,YANG Wenyu, CHEN Xianggui﹡

(SchoolofFoodandBioengineering,XihuaUniversity,Chengdu610039China)

Abstract:The aim of this research is to extract leaf protein concentrates(LPC) in Morus Alba leaves by cellulase enzyme. In single-factor experiment, the effect of ratio of solid-liquid, the amount of enzyme and extracting time on the dissolution rate LPC were investigated. The polynomial quadratic equations model was obtained by simulating the response surface analysis theory. At the same time, the optimum condition for the extraction of LPC in Morus Alba leaves assisted by cellulase enzymes is fixed. The amount of enzyme is 4%; the extraction duration is 2 hours; and the solid - liquid ratio is 1∶38(g：mL). In this condition, 49.056 LPC can be dissolved from 5g Morus Alba Leaves.

Keywords:LPC in Morus Alba Leaves；cellulase enzymes；response surface；technological parameter

doi:10.3969/j.issn.1673-159X.2016.02.015

中图分类号：S727.3

文献标志码：A

文章编号：1673-159X(2016)02-0077-5

*通信作者：陈祥贵(1967—), 男, 教授, 硕士生导师, 主要研究方向为疾病分子生物学、药物筛选。E-mail: chenxianggui@tom.com.

基金项目：成都市企业自主创新一般项目计划(12GGYB755NC-001)

收稿日期：2015-03-16