新型乙肝定量PCR试剂检测性能验证

徐江霞，龚淑琪，万振华，邓连瑞，洪建华(、南昌大学第四附属医院检验科，江西南昌330003；、江西省口腔医院，江西南昌330006)



新型乙肝定量PCR试剂检测性能验证

徐江霞1，龚淑琪1，万振华1，邓连瑞1，洪建华2
(1、南昌大学第四附属医院检验科，江西南昌330003；2、江西省口腔医院，江西南昌330006)

摘要:目的验证一种新型乙肝定量PCR试剂检测性能。方法参照ISO15189:2012要求，设计一系列实验对新型乙肝定量PCR试剂检测性能评价指标验证。结果①正确度验证：比对实验显示新型试剂与传统试剂（上海科华）相关性较好（y= 1.0259x+0.4857，R2=0.9534）；新型试剂参加2014年卫生部室间质评正确率100%。②精密度验证：新型试剂检测高（106）、低（104）浓度样本的批内及批间CV值均小于10%。③可报告范围验证：新型试剂在102～108范围内具有较好线性（y=-0.951x+ 9.1937，R2=0.99892>0.99）。④定量检测限：新型试剂检测原倍（103）、2倍、4倍稀释血清的CV值均小于15%，定量检测限可达到500IU/ml左右。结论新型试剂各项评价指标与厂家声明一致，符合PCR检测要求，具有较好的检测性能。

关键词：正确度；精密度；可报告范围；检测限

中国是乙型肝炎感染大国，约有10%的人群为乙肝病毒携带者，乙肝荧光定量PCR检测是用于乙肝疾病诊断及疗效的重要指标之一[1，2]。目前国内用于乙肝荧光定量PCR检测的试剂绝大部分采用传统的煮沸裂解法提取核酸，其有操作费时、样本需要量大、易形成气溶胶造成实验室污染以及易导致核酸丢失等问题[3]。近年来，一种新型的免核酸提取单管PCR反应开始应用，比如湖南圣湘生物开发的“一步法”乙肝荧光定量PCR检测试剂，即采用一种先进的核酸释放技术取代传统试剂的煮沸裂解法提取核酸，将微量的核酸释放剂与标本在PCR反应管内混合数分钟后直接加入PCR反应液进行扩增反应[4，5]。此新技术已获得国家批准，与传统试剂相比，具有操作简便、快速、节约样本、减少核酸污染及核酸丢失等优点，其应用于临床将大大提高基因扩增实验室检测效率，减少实验室污染。但目前该技术在我省各大医院临床应用尚不多见，其临床应用的检测性能仍有待验证。本研究参照ISO15189：2012[6]中有关“临床检验定量检测方法的确认和性能验证”的要求，拟开展一系列临床评价实验用于验证新型“一步法”乙肝定量PCR试剂的检测性能。根据本实验室的实际情况，本研究设计验证的性能指标将包含：正确度、精密度、可报告范围、检测限。

1　材料与方法

1.1实验标本来源本室日常检测血清标本；混合阴性血清由传统试剂（上海科华）和新型试剂（湖南圣湘）验证均为阴性的血清样本混合组成；2014年卫生部临床检验中心HBV DNA室间质评样本。

1.2仪器及试剂BIO-RAD实时荧光定量PCR仪（CFX-96），乙肝定量PCR试剂（湖南圣湘、上海科华）。

1.3实验方法

1.3.1正确度验证⑴比对实验：取40份日常血清标本（血清标本要求包含阴性、阳性样本，阳性样本浓度均匀分布在试剂说明书声明的检测线性范围内），取新型试剂和传统试剂同时检测（单次分析），严格按照试剂说明书操作，比较两试剂检测结果的相关性，绘制直线回归方程。⑵参加室间质量评价考核：采用新型试剂检测2014年卫生部临床检验中心10份HBV DNA室间质评样本，观察回馈正确率是否与厂家声明一致（100%）。

1.3.2精密度验证⑴批内不精密度：在一次扩增实验中采用新型试剂分别检测高浓度（106）、低浓度（104）水平血清样本各一份，每个样本重复检测10次，计算均数、标准差及CV值，观察CV值是否小于厂家声明（<10%）。⑵批间不精密度：采用新型试剂连续五日重复检测上述高浓度（106）、低浓度（104）水平血清样本，计算五日均数、标准差及CV值，观察CV值是否小于厂家声明（<10%）。

1.3.3可报告范围验证根据新型试剂说明书提供的可报告范围为5×102～5×109IU/ml，取本室（新型试剂）已检测到的一高浓度阳性血清样本（≥108IU/ml），用混合阴性血清10倍梯度稀释至101左右浓度，采用新型试剂检测，每个稀释度重复检测3次，取均值绘制直线回归方程，观察检测线性范围是否与厂家声明一致。

1.3.4检测限验证检测限包括空白检测限、检出限、定量检测限[7]。根据试剂说明书提供的定量检测限为500IU/ml，本研究主要设计验证定量检测限是否与厂家声明一致。取新型试剂检测的103左右的样本，用混合阴性血清按原倍、2倍、4倍、8倍稀释后，采用新型试剂检测，每个稀释度均做3个复孔，计算均数、标准差及CV值。CV值小于1/2允许误差（15%）对应的浓度水平即为定量检测限，验证其是否与厂家声明500IU/ml的定量检测限一致。

2　结果

2.1正确度验证

2.1.1比对实验比较新型试剂与本室使用的传统试剂（上海科华）对40份日常血清标本的检测结果的相关性，结果显示（图1）两种试剂检测结果相关性较好，回归直线方程为y=1.0259x+ 0.4857，R2=0.9534>0.95，说明两种试剂具有较好的延续性。

图1　圣湘试剂与科华试剂比对实验相关性分析

2.1.2室间质评考核正确率验证采用新型试剂检测2014年卫生部HBV DNA室间质评样本，回报结果（表1）显示全年10份样本正确率100%。

2.2精密度验证

2.2.1批内不精密度新型试剂批内重复性实验的扩增曲线（图2）呈光滑的“S”型曲线，样本扩增效率高且重复性好。定量结果（表2）显示高浓度（106）和低浓度样本（104）的批内CV值均小于10%。

2.2.2批间不精密度高浓度（106）和低浓度（104）样本的连续5日检测CV值均小于10%。见表2。

表1　2014年我室参加卫生部临床检验中心室间质评回报结果

表2　新型试剂批内及批间不精密度实验结果

图2　新型试剂批内重复性试验

2.3可报告范围验证新型试剂检测梯度稀释样本的扩增曲线（图3）间隔均匀，平滑优美。根据定量结果绘制直线方程（图4），结果显示新型试剂在102～108范围内具有较好线性（y=－0.951x+9.1937，R2=0.99892>0.99）。

2.4定量检测限验证新型试剂检测的原倍（103左右）、2倍、4倍、8倍稀释后定量结果（表3）显示：原倍、2倍、4倍稀释的CV值均小于15%，说明试剂定量检测限可达到500IU/ml左右。

图3　新型梯度稀释实验扩增曲线

图4　新型梯度稀释实验线性方程

表3　新型试剂定量检测限验证实验结果

3　讨论

本研究选择的性能验证指标包括：正确度、精密度、可报告范围和定量检测限。正确度即评价测量均值与真值的接近程度，本研究依据CLIS EP15-A2[8]文件要求，首先以日常检测标本为研究对象，采用新型试剂和我室既往使用的传统方法试剂同时检测，比较两种试剂检测结果偏移是否在可接受范围。结果显示两种试剂具有较好的相关性（R2>0.95），说明新型试剂与传统试剂具有较好的延续性，可替代传统方法试剂。再参照文献[9，10]，以全年卫生部室间质评样本为研究对象，采用新型试剂检测，比较检测均值与回报靶值之间的偏移是否与厂家声明一致。精密度即多次重复检测结果的一致性，包括批内和批间精密度。依据CLIS EP05-A2[11]文件要求，结合文献[10]，本研究设计比较新型试剂对高、低浓度样本单次实验中10次重复检测结果及连续5d重复检测结果的变异度（CV值）是否小于厂家声明。可报告范围即检测线性范围，依据CLIS EP06-A[12]文件提供的估计可报告范围要求，并参阅文献[9，10]，本研究选择与厂家声明的检测高限接近的高浓度血清样本，10倍梯度稀释至与厂家声明的检测低限接近的低浓度水平，计算不同浓度水平检测结果的线性回归方程。检测限即检测灵敏度，根据CLIS EP17-A2[7]文件对检测限的最新描述，检测限将包括空白限、检出限和定量限三个方面。本研究参考温冬梅[13]等对甲胎蛋白的研究，选择一低值样本（103左右）倍比稀释至试剂说明书给出的定量检测限接近的浓度，采用新型试剂重复检测，观察多次重复检测结果的变异度是否在可接受范围，由此验证新型试剂的定量检测限是否与厂家声明一致。本研究通过上述实验验证新型试剂具有较好的检测性能，其扩增效率好，扩增曲线优美平滑；正确度、精密度、可报告范围及定量检测限等均与厂家声明相符。

此外，本研究结果显示新型试剂定量结果普遍比传统试剂要高，并且重复性要优于传统试剂，这与陆金春[4]、李成德[5]、陈雪初[14]、叶剑荣[15]等人的实验结果相近，分析其原因可能来自以下两方面：⑴新型一步法试剂DNA提取效率高，样本核酸全部转入扩增，DNA没有任何损失；⑵传统试剂采用煮沸裂解法提取HBV DNA，提取过程中吸除上清液时很容易带走核酸，DNA损失较多，导致扩增效率低，定量结果偏低。

参考文献

[1]周丹.乙型肝炎病毒DNA实时荧光定量PCR检测在临床诊断中的价值[J]．检验医学与临床，2010，20(7)：2271-2272.

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[3]查瑶，王小灵，朱诗艳，等.煮沸裂解法与磁珠法在HBV DNA荧光定量检测中的核酸提取效果[J].浙江预防医学，2015，12：1292-1293，1296.

[4]陆金春，冯瑞祥，张敏，等.一种新型快速定量检测HBVDNA试剂的评价[J].临床检验杂志，2012，30(12)：976-980.

[5]李成德，黄晓佳，陈雄毅.不同核酸提取方法在HBV DNA荧光定量检测中的比较[J].国际检验医学杂志，2010，31（12）：1361-1363.

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[8]Clinical and laboratory standards. User verification of performance for precision and trueness；approved guideline-second edition[S]. EP15-A2. 2005.

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[11]Clinical and laboratory standards. Evaluation of precision performance of quantitative methods；approved guideline-second edition [S]. EP05-A2. 2004.

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[14]陈雪初，叶剑荣，蔡俊平. HBV-DNA免提取核酸荧光定量检测法应用评价[J].中国现代医学杂志，2011，22(11)：25-29.

[15]叶剑荣，袁利群，范旭，等.两种HBVDNA荧光定量试剂盒检测结果比较[J].国际检验医学杂志，2012，33(12)：1480-1481.

·实验研究·

(收稿日期2016-01-27；修回日期2016-03-17)

通信作者：龚淑琪，1979年12月出生，女，硕士学位，副主任医师（临床免疫学检验），研究方向：中药抗感染免疫。

作者简介：徐江霞，1965年2月出生，女，硕士学位，主任技师，主要研究方向：临床免疫学检验技术。

基金项目：江西省卫生计生委科技计划项目（编号：20155359）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.007

中图分类号：R512.6+2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)02-0149-03