正常大鼠的骨髓间充质干细胞对去势大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响①

张立超，贺　涛，帅　逸，常赫然，杜晓岩

(1.佳木斯大学附属第二医院颌面外科，黑龙江佳木斯154002;2.遵义医学院附属口腔医院牙周科，贵州遵义563000; 3.第四军医大学组织工程研发中心，陕西西安710032)



正常大鼠的骨髓间充质干细胞对去势
大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响①

张立超1，3，贺涛2，3，帅逸3，常赫然1，3，杜晓岩1

(1.佳木斯大学附属第二医院颌面外科，黑龙江佳木斯154002;2.遵义医学院附属口腔医院牙周科，贵州遵义563000; 3.第四军医大学组织工程研发中心，陕西西安710032)

摘要:目的:为研究正常大鼠的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)分泌的细胞因子对去势后大鼠的骨髓间充质干细胞BMMSCs成骨成脂分化能力的影响及机制。方法: 12只雌性SD大鼠随机分为假手术(sham)组，去势(ovx)组。建立sham和ovx模型。术后2个月取sham组和ovx组大鼠BMMSCs，分为sham(A)组、ovx(B)组、ovx细胞+ sham培养液(C)组、sham细胞+ ovx培养液(D)组进行间接共培养，RT－PCR检测各组BMMSCs成骨成脂相关基因; Western blot检测各组BMMSCs成骨成脂相关蛋白; Western blot检测Wnt经典信号通路相关蛋白。油红染色;茜素红染色。结果:成骨相关基因及蛋白表达以及Wnt经典通路的相关蛋白β－catenin和active－β－catenin组明显高于B组，D组低于A组;成脂相关基因及蛋白表达C组明显低于B组，D组高于A组。油红染色、茜素红染色结果与基因、蛋白的结果相一致。结论:正常大鼠BMMSCs分泌的细胞因子能够通过激活Wnt经典信号通路促进ovx大鼠BMMSCs的成骨分化并抑制其成脂分化。

关键词:骨质疏松;成骨分化;成脂分化;经典WNT信号通路

帅逸等发现通过静脉注射外源性BMMSCs能够缓解去卵巢大鼠的骨质疏松［1］，而外源性BMMSCs改善OVX大鼠BMMSCs成骨分化的机制尚不明确。研究表明，BMMSCs移植到体内大多数很快会死亡，而BMMSCs的治疗效果却能持续很久［2］。本研究目的是明确正常大鼠骨髓间充质干细胞是否通过分泌的细胞因子来改善去势大鼠的骨质疏松。

1　材料与方法

1.1材料

SPF级雌性SD大鼠12只，年龄10周，体重约200g［第四军医大学实验动物中心］，α－MEM培养基和胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，茜素红(天津科密欧公司)，油红，Trizol reagent(invitroge公司)，反转录试剂盒(Toyobo公司)，β－甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，3－异丁基－1－甲基黄嘌呤和吲哚美辛(Simgo公司)，胰岛素(万邦制药)，大鼠β－actin，OCN，RUNX2引物(上海生工)，大鼠碱性磷酸酶，RUNX2，SP7，β－Catenin，active－β－Catenin，PPAR－γ抗体(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1构建ovx和sham模型: ovx组10周大鼠麻醉后备皮，在肋骨下一指宽、脊柱双侧一指半宽处切开，切除卵巢，缝合; sham组切开后不摘除卵巢，其余操作相同。饲养2个月。

1.2.2 BMMSC的培养:全骨髓贴壁培养法。以2 ×107个接种于75cm2的培养瓶中，含10%胎牛血清的α－MEM培养基，至于37℃、5% CO2浓度的培养箱，24h换液，细胞生长至80%传代。收集sham组和ovx组培养液。

1.2.3 BMMSC的间接共培养: sham组和ovx组细胞分别接种于6孔板中，分为sham(A)组、ovx(B)组、ovx细胞+ sham培养液(C)组、sham细胞+ ovx培养液(D)，共培养48h。

1.2.4 BMMSC成骨成脂能力的检测:以每孔1× 105个细胞接种于12孔板。成骨诱导7d，ALP染色，成骨诱导21d，茜素红染色，观察染色能力;成脂诱导7d，油红染色，镜下观察脂滴形成。

1.2.5 RT－PCR法检测成骨成脂相关基因表达:成骨诱导7d，Trizol法提取RNA，反转录，实时定量扩增OPG，OCN、Runx2;成脂诱导3d，Trizol法提取RNA，反转录，实时定量扩增LPL和PPAR－γ。

1.2.6 Western blot法检测成骨成脂相关蛋白表达:成骨诱导7d，Western blot法检测碱性磷酸酶，Runx2，SP7的表达;成脂诱导7d，Western blot法检测PPAR－γ的表达。

1.2.7成骨成脂相关通路标志蛋白的检测: Western blot法检测各组成骨成脂诱导中WNT/β－catenin信号通路标志蛋白β－catenin，Active－β－catenin的表达。

2　结果

2.1骨质疏松模型建成: OVX组大鼠与sham组相比，骨密度下降明显; sham组骨密度无明显变化。

2.2正常大鼠BMMSC分泌的细胞因子等能够促进OVX大鼠BMMSC成骨分化而抑制其成脂分化

2.2.1正常BMMSC分泌的细胞因子能促ovx细胞成骨抑成脂:茜素红染色结果显示C组颜色较B组颜色深，D组较A组浅(图1) ;油红染色显微镜下结果显示C组油滴较B组少，D组较A组多(图2)。

2.2.2正常BMMSC分泌的细胞因子能促进ovx细胞成骨基因表达: C组成骨基因RUNX2、OCN表达明显高于B组，D组略低于A组; C组成脂基因PPAR－γ、LPL表达明显低于B组，D组略高于A组(图3)。

2.2.3正常BMMSC分泌的细胞因子能促进ovx细胞成骨蛋白表达: C组成骨蛋白RUNX2、SP7明显高于B组，D组略低于A组; C组成脂蛋白PPAR－γ明显低于于B组，D组略高于A组(图4)。

图1　茜素红染色成骨能力对比

图2　显微镜镜下10×油红O染色成脂能力对比

图3　成骨成脂基因表达对比

图4　成骨成脂蛋白对比

2.3正常细胞分泌的细胞因子等能够激活OVX大鼠BMMSC的WNT/β－catenin通路促进成骨分化同时抑制成脂分化:成骨成脂中，C组β－catenin的表达B组与C组差异不明显，C组Active－β－catenin的表达明显高于B组，D组低于A组(图5)。

图5　经典WNT通路活化水平对比

3　讨论

研究表明，雌激素缺乏时，机体内环境改变，内源性BMMSC成骨能力下降，破骨细胞增多，引起骨改建紊乱，形成骨质疏松［3～5］。无论骨质疏松症患者及动物模型其BMMSCs的成骨能力都是下降的。如果能够恢复内源性BMMSCs的成骨分化能力能够极大的缓解甚至治愈骨质疏松症。帅逸［1］等通过从大鼠尾静脉系统注射BMMSCs，发现系统注射正常的BMMSCs能够使相关的成骨基因表达上升，MICRO CT结果显示骨小梁增多且骨密度上升，这说明系统注射BMMSCs确实能够极大的缓解大鼠骨质疏松症。关于干细胞的研究有很多［6］，干细胞治疗也应经在许多疾病中应用［7］，系统注射BMMSCs后主要转移到肺部，并且很快就消失［2］，但是BMMSCs的治疗效果会持续很长时间。

正常的BMMSCs能够分泌很多细胞因子［8，9］，本实验结果显示，去势后大鼠的BMMSC成骨能力降低而成脂能力升高;加入培养过正常BMMSC的培养液后，内源性BMMSC的成骨能力增强而成脂能力降低，这表明正常BMMSC分泌的细胞因子等能够改善内源性BMMSC成骨分化能力同时抑制其成脂能力;成骨成脂诱导后，同OVX组相比较，加入正常BMMSCs培养液的C组的WNT经典通路的标志蛋白Active－β－catenin、p－GSK－3β表达上升，WNT信号通路的活化程度较OVX组高。前文提到，WNT经典信号通路能够调节BMMSC的成骨成脂分化，当其激活时，能够促进BMMSC的成骨细胞分化并抑制其向成脂细胞分化。本实验表明，正常BMMSC分泌细胞因子，并且这些细胞因子能够表现出促进内源性BMMSC成骨同时抑制其成脂的效果是通过增强经典WNT信号通路来实现的。本实验阐明了系统注射正常BMMSCs能够恢复内源性BMMSCs成骨分化能力的机制，为BMMSC系统注射治疗骨质疏松提供了理论基础;最近的研究表明，系统注射BMMSC治疗存在风险，例如，通过静脉注射MSC可能会引起急性猝死，MSC治疗可能引起肿瘤，移植物的排异反应，增加某些疾病的易感性等等。本实验提供了一个新的干细胞治疗的策略，我们可以使用干细胞分泌的细胞因子来治疗一些相关疾病，这样可以避免那些干细胞带来的不良反应及其他并发症的危险。干细胞治疗的使用量是比较大的，而在不影响供体健康的情况下所能提供的细胞数量是有限的，这样无法避免干细胞在体外扩增，而且代数可能会比较高。这样问题也随之而来。随着体外扩增，干细胞代数的增加，细胞的干性也会随之减弱［10～12］，治疗效果会大打折扣，并且治疗风险也会大大增加。应用干细胞分泌的细胞因子来进行相关疾病的治疗能够避免这些风险，，并且解决了干细胞来源少及达到为治疗细胞数量而体外扩增引起代数变高的问题，为疾病治疗提供了新的减少风险的思路。

参考文献:

［1］帅逸.外源性BMMSCs通过改善内源性BMMSCs成骨分化能力缓解去卵巢大鼠骨质疏松［J］.基础医学与临床，2014，34(5) : 610－614

［2］Lama VN.Evidence for tissue－resident mesenchymal stem cells in human adult lung from studies of transplanted allografts［J］.J Clan Invest，2007，117 (4) : 141－150

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［11］周盛轩，潘进钱，叶盛.传代对大鼠胚胎神经干细胞增生、凋亡和分化影响［J］.医学研究杂志，2007，1: 62－165

［12］程春凤，杨智，李壮，等.比较四种消化方法对神经干细胞传代增殖及活性的影响［J］.黑龙江医药科学，2012，35(2) : 1－2

The effect and mechanism of BMMSCs ameliorate on the differentiation function of BMMSCs in ovariectomized rats

ZHANG Li－chao1，3，HE Tao2，3，SHUAI Yi3，CHANG He－ran1，3，DU Xiao－yan1
(1.Dept of Oraland Maxill of Acial Surgery，the Second Affiliated Hospital of Stomatology，Jiamusi University，Jiamusi 154002，China; 2.Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical Collage，Department of Periodontology，Zunyi 563000，China; 3.Tissue Engineering R＆D center，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)

Abstract:Objective: To investigate the effect and mechanism of BMMSCs cytokines ameliorate the osteogenesis and adipogenesis of BMMSCs in ovariectomized rats.Methods: Twelve female goats were randomly divided into sham group (sham) and bilateral ovariectomy group (OVX).Sham and OVX model was established.Two months after operation，BMMSCs were extracted and divided into sham (group A)，OVX (group B)，OVX cells and sham culture medium (group C) and sham cells and OVX culture medium (group D).Osteogenesis and adipogenesis of the four groups were examined by alizarin red staining，real－time PCR and western blot.The Wnt canonical passway was examined by western blot.Results: The gene and protein expressions of osteogenesis and the active－β－catenin and p －GSK－3β of Wnt canonical passway: group C was higher than those in group B，and group D was lower than those in group A.The gene and protein expression of adipogenesis: group C was lower than that in group B，and group D was higher than that in group A.Conclusions: BMMSCs cytokines can activate Wnt canonical passway，promote osteogenesis differentiation and inhibit adipogenesis differentiation of BMMSCs in ovariectomized rats.

Key words:osteoporosis; osteogenic differentiation; adipogenic differentiation; Wnt signaling pathway

(收稿日期:2015－04－01)

通讯作者:杜晓岩(1968～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E－mail: duxiaoyan@163.com。

作者简介:①张立超(1987～)男，黑龙江肇东人，在读硕士研究生。

中图分类号:R681

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0093－03