腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及其机制

尉娜，李静，李娟，谭军

(新乡医学院第三附属医院，河南新乡 453003)

腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及其机制

尉娜，李静，李娟，谭军

(新乡医学院第三附属医院，河南新乡 453003)

目的 探讨腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及其机制。方法 将健康雄性成年SD大鼠224只随机分为假手术组、腺苷预处理后假手术组、缺血再灌注组和腺苷预处理组，每组56只。各组均采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型，假手术组及腺苷预处理后假手术组不插线栓；手术前3天，假手术组和缺血再灌注组腹腔注射生理盐水，腺苷预处理后假手术组和腺苷预处理组腹腔注射腺苷注射液。各组于缺血再灌注3、7、14、21天分别处死大鼠16只，并制备大脑组织切片。应用HE染色观察局灶性脑缺血再灌注后皮质及海马神经元的形态学改变，采用免疫组化法观察局灶性脑缺血再灌注后皮质及海马区Nestin阳性细胞数。结果 HE染色：假手术组、腺苷预处理后假手术组脑组织各层神经元排列整齐、规则，无坏死细胞。缺血再灌注组缺血再灌注3天，大鼠脑皮质及海马神经元排列稀疏，有崩解、丢失现象；缺血再灌注7、14、21天，上述病理变化减缓。腺苷预处理组在相应时间点较缺血再灌注组脑组织病理改变有明显改善，尤以7天后改善更明显。免疫组织化学染色：假手术组、腺苷预处理后假手术组皮质少见Nestin阳性细胞表达，海马区有少量Nestin阳性细胞表达；缺血再灌注组、腺苷预处理组Nestin阳性细胞数量于再灌注3天开始增加，缺血再灌注组于7天达高峰，腺苷预处理组于14天达高峰，随后开始逐渐下降；腺苷预处理组各时间点皮质、海马区Nestin阳性细胞数量均明显高于缺血再灌注组(P均<0.05)。结论 腺苷预处理能显著减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织神经元的损伤程度，可能与其促进内源性神经干细胞的增殖有关。

脑缺血再灌注；腺苷；内源性神经干细胞；大鼠

缺血性脑血管病是一类常见病、多发病，脑缺血后神经细胞损伤的不可再生性导致其极高的致残率与病死率。减轻脑缺血后的神经损伤、提高脑组织对缺血的耐受一直是临床预防和治疗缺血性脑血管病的重点和难点。本研究即探讨腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞(NSCs)增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物及分组：健康雄性SD大鼠224只，体质量250～300 g，由新乡医学院实验动物中心提供。腺苷注射液(沈阳光大制药有限公司，批准文号：国药准字H20030320、规格：6 mg/2 mL)，Nestin多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，Nikon MODEL YS100显微镜(Nikon)，照相显微镜HPIAS-2000显微图象定量分析系统(郑州太阳电子科技有限公司)。

1.2 造模与分组处理 将224只大鼠随机分为假手术组、腺苷预处理后假手术组、缺血再灌注组和腺苷预处理组，各56只。各组均采用改良尼龙线栓塞法制备大脑中动脉阻塞模型[1,2]；阻断大脑中动脉2 h后，轻轻向外抽拉尼龙线至颈外动脉主干，大脑动脉Willis环和大脑中动脉已恢复血供，保持体温至清醒。假手术组及腺苷预处理后假手术组不插线栓，其余处理同缺血再灌注组和腺苷预处理组。假手术组和缺血再灌注组于手术前3天开始腹腔注射生理盐水，2 mL/次、1次/d；腺苷预处理后假手术组和腺苷预处理组于手术前3天开始腹腔注射腺苷注射液，剂量为1.5 mg/kg，生理盐水稀释到2 mL，1次/d。大鼠术后单笼饲养，自由饮水和进食。

1.3 相关指标观察 各组根据再灌注时间于缺血再灌注3、7、14、21天分别处死大鼠14只，取出大脑至培养皿中，切取视交叉前后各2 mm厚的脑组织，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中固定24 h，脱水透明，石蜡包埋，20 μm切片，用于HE染色及免疫组化染色。

1.3.1 皮质及海马区神经元形态改变 采用HE染色法。将制备好的切片脱蜡、水化，浸入苏木素染液，淡氨水中返蓝，伊红染液染色3～4 min，脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察。

1.3.2 皮质及海马区NSCs增殖情况 采用免疫组化染色法。按照Nestin免疫组化染色试剂盒说明书进行，光镜观察并应用HPIAS-2000显微图像处理系统采集图片，每张切片随机取8～10个视野，计数Nestin阳性细胞数，求其平均值为该张切片Nestin阳性细胞数。Nestin阳性判断标准：胞质呈棕褐色，胞体呈圆形、椭圆形、椎体形和三角形等，排列不规则，有聚集现象，并可见有深染的1个或多个突起，胞核淡染。

2 结果

2.1 各组皮质及海马区神经元形态学变化 假手术组、腺苷预处理后假手术组皮质各层神经元排列紧密而整齐，结构清晰，胞体饱满，分布均匀，无数量减少及异常形态学改变，未见到死亡神经元；海马CAI区锥体细胞层排列规则、紧致，细胞轮廓清楚。缺血再灌注3天，大脑皮质、海马区神经元排列稀松，神经组织失去完整结构，有细胞破裂、胞核溶解现象，细胞周围高度水肿，梗死周围有胶质细胞增殖。再灌注7、14、21天上述病理改变趋势减缓。腺苷预处理组在相应再灌时间点较缺血再灌注组脑组织病理改变明显改善，缺血再灌注7天改善尤为明显。见插页Ⅲ图4。

2.2 各组皮质及海马区NSCs增殖情况比较 见表1、2。

表1 各组不同时间点皮质Nestin阳性细胞数量比较±s)

注：与缺血再灌注组比较，▲P<0.05。

表2 各组不同时间点海马区Nestin阳性细胞数量比较±s)

注：与假手术组、腺苷预处理后假手术组比较，▲P<0.01；与缺血再灌注组比较，★P<0.05。

3 讨论

脑缺血预处理(CIP)是指对脑进行二次或多次短暂的亚致死性缺血、缺氧或药物预处理，调动机体组织的自身保护机制，达到减轻脑缺血再灌注损伤的目的，CIP是目前认为较为有效地避免脑缺血再灌注损伤的治疗方法，在实际临床工作中多采用药物预处理，目前常用药物主要有中药、麻醉药、钙离子通道拮抗剂等。研究发现，许多外源性药物应用于脑缺血再灌注时，通过不同途径刺激内源性腺苷的分泌来达到保护脑组织的目的[3]，因此我们考虑外源性腺苷也可以治疗脑缺血再灌注损伤[4～6]。本研究腺苷预处理组在相应再灌时间点较缺血再灌注组脑组织缺血有明显改善，缺血再灌注7天改善更明显，证实腺苷预处理可改善大鼠脑缺血再灌注损伤。

近年研究发现，脑组织受到缺血性损伤时可以刺激内源性NSCs的增殖、分化，从而促进神经再生和功能的重建[7～9]。然而在这种状态下的NSCs增殖能力十分有限，对受损脑组织的功能修复作用甚微。因此，深入研究脑缺血后NSCs增殖的发生机制及影响因素，通过不同途径和方法促进内源性NSCs适时增殖和分化是治疗缺血性脑血管病的关键。Nestin是能够特异性表达在早期原始神经细胞上的分子标记物，在出生后表达停止，随着干细胞分化、成熟，逐渐可以被胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白等中间丝蛋白替代[10]。Nestin作为目前识别NSCs的重要标志蛋白之一，已被广泛用于标记NSCs。Nestin阳性表达的细胞，可看作是NSCs[11～13]。本研究结果显示，假手术组与腺苷预处理后假手术组皮质未见到Nestin阳性细胞，海马区有少量Nestin阳性细胞，提示内源性NSCs在成年大鼠脑内基本处于静息状态。缺血再灌注组脑缺血再灌注后Nestin阳性细胞表达有所增加，说明脑损伤后存在内源性NSCs增殖。腺苷预处理组Nestin阳性细胞明显多于缺血再灌注组，且随处理时间延长表达增加，峰值出现在缺血再灌注后第14天；第21天Nestin阳性表达仍高于缺血再灌注组，说明腺苷可促进在体NSCs的增殖，并能增强NSCs的增殖能力。其可能的作用机制：腺苷主要通过4种膜受体发挥生物学效应，分别为A1、A2a、A2b和A3，A1腺苷受体可在NSCs上表达，其活化也能促进NSCs的增殖，活化的A1腺苷受体可能通过激活MEK/ERK和AKt信号通路，促进NSCs的增殖[14,15]。

综上所述，腺苷预处理能显著减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织神经元的损伤程度，其机制可能为促进局灶性脑缺血损伤后内源性NSCs增殖。

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新乡市重点科技攻关项目(ZD2011-27)。

谭军(E-mail: tanjun1997@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.011

R734.3

A

1002-266X(2016)20-0033-03

2015-10-13)