复方黑骨藤抗类风湿关节炎作用及机制的研究

侯玉婷,　黎　霞,　张　宏,　王菡钰,　张晓凰,　汤义珍

(四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101)



复方黑骨藤抗类风湿关节炎作用及机制的研究

侯玉婷,黎霞,张宏*,王菡钰,张晓凰,汤义珍

(四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101)

摘要：目的：研究复方黑骨藤对类风湿关节炎(RA)的治疗作用及其作用的分子机制.方法：将实验大鼠分组并建立佐剂性关节炎(AA)动物模型，观察复方黑骨藤低、中、高剂量对AA大鼠足肿胀、体重、器官指数及血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量水平的影响.结果：复方黑骨藤能有效抑制AA大鼠足肿胀，降低胸腺指数，下调AA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平.结论：复方黑骨藤具有良好的抗RA作用，其作用机制可能与调节免疫器官功能及减少IL-1、IL-6、TNF-α的产生，从而达到抗炎消肿和阻止关节软骨破坏的作用有关.

关键词：复方黑骨藤; 类风湿关节炎; 白细胞介素-1β; 肿瘤坏死因子-α; 白细胞介素-6

类风湿关节炎(RA)是以关节滑膜为靶器官的影响活动关节的自身免疫性疾病，其主要病理基础为滑膜炎症[1]，主要表现为免疫调节失衡、关节组织慢性炎症病变.其发病机制涉及抗原、免疫细胞、细胞因子等多种因素参与的一系列免疫反应[2-3]，入侵的抗原被滑膜细胞吞噬、加工、处理后，将抗原信息传递给并激活T淋巴细胞，使之释放出多种细胞因子、生长因子及各种递质，最终导致了滑膜炎及血管翳的生成，进而出现关节畸形及功能丧失[4].黑骨藤具有祛风除湿、舒筋活血、止痛等功效，主治风湿麻木疼痛，跌打损伤、骨折、骨痛等[5]，药理研究表明它在治疗风湿与类风湿性关节炎等疾病方面有明显的疗效[6]，且作用明显，毒副作用小.复方黑骨藤是以黑骨藤为主药，配以秦艽、元胡两味中药经乙醇超声提取后所得.

1材料

1.1实验动物SPF级SD大鼠，雄性，体质量(180±10) g.由四川省实验动物专委会养殖场提供，生产许可证为SCXK(川)2013-24.

1.2药材与药品黑骨藤PeriplocaforrestiiSchltr. 药材购买于西昌药材市场，经成都中医药大学张艺鉴定；秦艽(GentianamacrophyllaPall.,批号：20130526)及元胡(Rhizomacorydalis，批号：20130605)均购买与北京同仁堂股份有限公司.醋酸泼尼松片(批号：国字准药：H33021207，规格5 mg/片，浙江仙琚制药股份有限公司生产)；雷公藤多苷片(批号：国药准字Z31020415，规格10 mg/片，上海复旦复华药业有限公司生产)；复方黑骨藤(高、中、低剂量组)由本实验室自制.

1.3试剂与仪器弗氏完全佐剂Freund’ scomplete adjuvant,FCA，sigma公司生产)，IL-1β、IL-6、TNF-α定量ELISA试剂盒(均由上海邦奕公司生产，批号分别为DRE20113，DRE20064，DRE20040).全波长紫外分光光度计(Mss，成都军能海尔思科技有限公司)，离心机(Anke TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)，动物天平(ESJ120-3，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)，PV-200足肿胀测定仪(TW025-0812，成都泰盟科技发展有限公司生产).

2方法

2.1动物分组及造模取SD健康雄性大鼠70只，鼠龄3月，适应性饲养1周后，实验前将动物随机分为空白对照组、模型组、醋酸泼尼松组、雷公藤多苷片组、复方黑骨藤(高、中、低剂量)组共7组，每组各10只.实验当天，参照文献[7]的佐剂性关节炎造模方法，除空白组外，每只大鼠右后足趾皮下注射0.1 mL弗氏完全佐剂致炎，空白组注射等量0.9%氯化钠溶液.大鼠注射弗氏完全佐剂6 h后，足肿胀开始持续增加，膝关节变大，说明造模成功.

2.2给药致炎24 h后，分别给实验鼠灌胃相应的药液，空白组和模型组每天灌胃质量分数5‰ CMC-Na溶液；阳性组分别灌胃醋酸泼尼松29.2 mg·kg-1·BW、雷公藤多苷37.5 mg·kg-1·BW；复方黑骨藤高、中、低剂量组分别灌胃剂量67、44、22 mg，每天每只大鼠灌胃1次，2 mL/只.连续灌胃21 d.

2.3大鼠足肿胀的测定用PV-200足肿胀测定仪分别于造模后第18小时、2、4、7、11、14、21天测量各组大鼠左、右足足跖容积，计算出足肿胀容积差值(足肿胀容积差=右足足拓容积-左足足拓容积).

2.4大鼠体重的测定于致炎前和致炎后第2、8、15、21天称量大鼠体重，统计各组大鼠体重变化.

2.6血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量测定持续给药21 d后将大鼠处死，心脏取血，检测血液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.测定方法为：血液以3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA方法分别测得血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.

3结果

3.1药物对AA大鼠足肿胀的影响造模后，模型组从第1天起持续肿胀至第4天，而后开始逐渐消退；第11天后肿胀继续发生，与空白组对照有极显著差异(P<0.01).阳性组、复方黑骨藤组与模型组比较差异显著(P<0.05)；雷公藤多苷组、复方黑骨藤高、中、低剂量组均能明显减轻AA大鼠膝关节炎症，使肿胀度明显下降(P<0.05)；醋酸泼尼松组对AA大鼠膝关节炎症的改善极明显，使肿胀度能够显著下降(P<0.01).

表 1　复方黑骨藤对SD大鼠膝关节病变的影响+s)

注:与模型组对比1:P<0.05；与模型组对比2:P<0.01；与空白组对比3:P<0.01.

3.2药物对AA大鼠体重的影响从表2可知，模型对照组、醋酸泼尼松组于注射佐剂后第8天与空白组大鼠体重对照，差异极显著(P<0.01)，注射佐剂后大鼠的体重发生了变化，先正常生长，后体重开始增长缓慢.雷公藤多苷组、复方黑骨藤组与模型组大鼠体重比较，于21 d后出现显著性差异，且各组大鼠的活动，进食正常，体重增加，且较空白组没有显著性差异.

3.3药物对AA大鼠个脏器指数的影响从表3可知，醋酸泼尼松对胸腺、脾脏有显著抑制作用，较模型组差异极显著(P<0.01)，胸腺、脾脏出现了萎缩；复方黑骨藤高、中剂量组也能够降低胸腺指

表 2　复方黑骨藤对AA大鼠体重的影响

注:与模型组对比1:P<0.05；与模型组对比2:P<0.01；与空白组对比3:P<0.01.

表 3　复方黑骨藤对AA大鼠各脏器指数的影响+s,n=10)

注:与模型组对比1:P<0.05；与模型组对比2:P<0.01；与空白组对比3:P<0.01.

表 4　复方黑骨藤对AA大鼠血浆中IL-1β、IL-6、 TNF-α含量的影响

注:与模型组对比1:P<0.05；与模型组对比2:P<0.01；与空白组对比3:P<0.01.

数，与模型组比较有显著差异(P<0.05)，但不及醋酸泼尼松组.雷公藤多苷片和复方黑骨藤组的肾脏、脾脏、指数较空白组的高；醋酸泼尼松组、雷公藤多苷组、剂量复方黑骨藤组的肝脏指数较模型组的高.

3.4药物对AA大鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影响从表4可见，醋酸泼尼松降低了AA大鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平，与模型组比较差异极显著(P<0.01)；雷公藤多苷片组、低、中、高剂量复方黑骨藤组与模型组比较也有显著性差异(P<0.05)，表明雷公藤与复方黑骨藤均有不同程度的降低血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平.低剂量复方黑骨藤组与雷公藤多苷组之间的差异不显著.

4讨论

RA是一种严重影响人类健康的以关节滑膜炎症病变为主要特点的全身性、慢性、自身免疫性疾病，胸腺、脾脏等指数的变化也是反映动物机体免疫功能的最基本和最常规的指标之一.作为初步观察药物对免疫功能影响的指标，本试验目前研究结果表明，复方黑骨藤能显著降低胸腺指数，提高肾脏、肝脏、脾脏指数，提示黑骨藤可能通过调节免疫器官功能来提高抗类风湿关节炎作用的能力，其与雷公藤多苷没有显著性差异，但不及醋酸泼尼松.醋酸泼尼松对AA大鼠的体重增长有较大的影响，并使其胸腺极度萎缩，表现出较强的免疫抑制作用.

国内外研究发现RA的发生发展与细胞因子有密切关系，RA发生机制是由于患者体内细胞因子网络自身调节系统被破坏，细胞因子异常产生及功能紊乱所引起[8].在细胞因子网络中以白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)为代表的致炎性细胞因子研究的比较多，它们在触发滑膜细胞激活导致关节受损和诱导炎症过程中起着重要作用[9].IL-1β和TNF-α主要由单核细胞及巨噬细胞产生[10]，二者相互协调、促进，它们的效应及靶细胞的范围有很大的相似性，均是RA致病机理中具中心地位的促炎症细胞因子，参与RA发生发展的全过程.IL-1β、TNF-α均可通过刺激滑膜组织滑膜细胞核软骨细胞中IL-6、前列腺素E2、胶原酶和基质金属蛋白酶的合成释放，引起RA患者免疫功能紊乱，局部炎症反应加剧，骨与软骨基质不可逆破坏，以及血管翳形成[9,11]；同时使破骨细胞减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并产生胶原酶和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨和软骨破坏[12].大量研究表明TNF-α和IL-1β在滑膜炎症中高度表达，通过抗肿瘤坏死因子α和白细胞介素β的治疗，减少TNF-α和IL-1β表达，对治疗类风湿关节炎有确切的疗效[4,13].IL-6是一种促炎症细胞因子，能增强IL-1和TNF-α的效应，被认为是TNF-α的某些生物效应的放大因子[14].IL-6能够促进B细胞增殖，并分化为免疫球蛋白分泌细胞，促进肝脏合成急性相关蛋白和促进类风湿因子的合成[15].此外IL-6可以通过提高骨细胞和滑膜细胞中细胞核因子κβ活化因子配体的释放，促进破骨细胞生成因子表达[16].而且研究也表明RA患者血清及滑膜液中IL-6及IL-6R浓度升高，IL-6的水平和疾病活动性及临床表现有密切关系[17].本研究发现模型组AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量均显著高于空白组大鼠(均P<0.01)，证明细胞因子网络失衡在类风湿关节炎的病程发展中发挥重要作用.AA大鼠经过治疗后，细胞因子水平明显降低，其中醋酸泼尼松和高剂量复方黑骨藤下降最为明显(P<0.01)，雷公藤多苷和低、中剂量复方黑骨藤组下降比较明显(P<0.01，P<0.05)，表明醋酸泼尼松、雷公藤多苷、复方黑骨藤均可降低细胞因子水平，且中剂量复方黑骨藤较雷公藤多苷片效果更加明显.说明复方黑骨藤能减少IL-1β、IL-6及TNF-α的产生，从而达到抗炎及阻止软骨破坏的作用来发挥抗RA的作用.这可能是复方黑骨藤方治疗RA的途径之一，这与其他研究成果相似[18-24].

该研究为复方黑骨藤用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的分子机制提供了实验依据，同时更进一步地验证了在关节抗炎和免疫抑制及阻止软骨破坏的作用方面，显示了复方黑骨藤具有较大的开发和应用前景.

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(编辑周俊)

Effects and Mechanism ofPeriplocaforrestiiSchltr.Compound Against Rheumatoid Arthritis

HOU Yuting,WANG Hanyu,LI Xia,ZHANG Hong,ZHANG Xiaohuang,TANG Yizhen

(SchoolofLifeSciences,SichuanNormalUniversity,Chengdu610101,Sichuan)

Abstract：To achieve the anti-arthritic effects and the possible molecular mechanism against rheumatoid arthritis (RA), the Periploca forrestii Schltr. Compounds were studied by observing the changes of paw swelling, body weight, viscera index and levels of interleukin 1β(IL-1β), interleukin 6(IL-6)and tumor necrosis factor α(TNF-α) after medication with establishing Freund’s adjurant arthritis (AA) rat model. It shows that Periploca forrestii Schltr. compound effectively inhibits articular swelling, decreases thymus index and regulates down the content of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the serum of AA rats by reducing the production of IL-1β, IL-6 and TNF-α as well as inhibiting joint damage.

Key words：Periploca forrestii Schltr compound; rheumatoid arthritis; interleukin-1β; tumor necrosis factor-α; interleukin-6

doi:10.3969/j.issn.1001-8395.2016.01.022

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-8395(2016)01-0123-05

*通信作者简介：张宏(1965—)，女，教授，主要从事天然产物化学的研究,E-mail:401923129@qq.com

基金项目：国家自然科学基金(31240087)

收稿日期:2015-03-25