基于厌氧生物制气的糙皮侧耳预处理甘蔗叶工艺

陈柳萌，桂 伦,马吉平，陈庆隆，陈 葵，李婉晴，张 诚*

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.江西省山江湖开发治理委员会办公室，江西 南昌 330046；

3.江西中医药大学 附属医院,江西 南昌 330004)

基于厌氧生物制气的糙皮侧耳预处理甘蔗叶工艺

陈柳萌1，桂 伦1,马吉平1，陈庆隆1，陈 葵2，李婉晴3，张 诚1*

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.江西省山江湖开发治理委员会办公室，江西 南昌 330046；

3.江西中医药大学 附属医院,江西 南昌 330004)

为获得基于厌氧发酵发酵产沼气为目标的糙皮侧耳预处理甘蔗叶工艺，以糙皮侧耳对甘蔗叶的降解特性试验为基础，研究了碱处理、接种量、培养温度、培养湿度等因素对菌丝生长的影响，确定了预处理工艺，并通过厌氧发酵产沼气试验进行验证，结果表明：当预处理条件为1% Ca(OH)2浸泡1 h、接种量50%、培养温度28 ℃、培养湿度60%时；甘蔗叶经糙皮侧耳预处理25 d，可有效改善甘蔗叶的厌氧产气性能，沼气总量为33957 mL、发酵物料的木质素降解率为52.1%，分别较对照组提高了28.9%、26.2%。

厌氧制气；糙皮侧耳；甘蔗叶；预处理；工艺

农作物秸秆问题被认为是比较突出的农业环境问题，特别是随着作物产量的连年提高，农作物秸秆量超过9亿t，其中可以收集的秸秆量达8亿t。秸秆中的3种主要成分——纤维素、半纤维素和木质素均为具有复杂空间结构的高分子聚合物，它们相互结合形成复杂的超分子复合物，并进一步形成各种各样的植物细胞壁结构[1]，这些复杂的三维空间结构使植物体得以避免微生物及各种物理、化学因素的伤害。这种复杂结构带来的难降解性也正是木质纤维素材料一直未得到有效利用的主要原因[2]。

沼气作为一种重要的生物质能源，是可再生能源的重要组成部分[3]。多原料混合制气是未来沼气工程的发展趋势，可有效解决当前沼气工程因原料单一(目前以畜禽粪便为主)而无法实现规模化、周年化运行。因此，强化农作秸秆的可消化性，打破木质素对纤维素和半纤维素的保护，是秸秆类物质进行厌氧发酵制沼气的关键。

本文以实验室收集的糙皮侧耳(H8)为预处理菌株，开展甘蔗叶(一种主要的热带作物秸秆)预处理工艺研究。即在糙皮侧耳对甘蔗叶的降解特性试验的基础上，研究碱处理、接种量、培养温度、培养湿度等因素对菌丝生长的影响，以此建立预处理工艺，最终通过厌氧发酵产沼气试验分析预处理效果。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗叶收集自中国热带农科院加工所，为自然风干、无霉变，剪碎至1～2 cm后备用。糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)由江西省农科院农业应用微生物研究所食用菌研究室提供，编号H8。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂 所用试剂：蔗糖、硫酸二氢钾、七水合硫酸镁、乙酸、乙酸钠、酒石酸、酒石酸钠、藜芦醇、乳酸、乳酸钠、硫酸锰、双氧水、ABTS、盐酸、硫酸、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、硼酸钠、乙二醇乙醚、无水磷酸氢二钠。

1.2.2 仪器 UV 765紫外可见光光度计、电热鼓风干燥箱、马弗炉、立式压力蒸汽灭菌器、人工气候培养箱、生化培养箱、H/T16MM台式高速离心机、沼气厌氧发酵装置、烧杯、锥形瓶、接种针、电子天平、培养皿、打孔器、摇床。

1.2.3 培养基 PDA固体培养基：去皮马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂16 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1000 mL，pH自然。

PDA液体培养基：去皮马铃薯200 g，蔗糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1000 mL，pH自然。

Krik培养基[4]：酒石酸铵0.22 g，K2HPO40.2 g，MgSO40.05 g，CaCl20.01 g，VB10.001 g，微量元素溶液10 mL，ddH2O 990 mL，pH 7.0。

微量元素溶液：MgSO43.0 g，MnSO40.5 g，NaCl 1 g,CoSO4100 mg，CaCl283 mg,ZnSO4100 mg,CuSO4·5H2O 100 mg，FeSO4·5H2O 100 mg，AlK(SO4)210 mg，H3BO310 mg，NaMoO410 mg，ddH2O 1000 mL,pH 7.0。

1.3 试验方法

1.3.1 糙皮侧耳对已灭菌甘蔗叶的木质纤维素降解特性试验 用无菌接种针将糙皮侧耳菌株从保存的斜面上挑出，转接到PDA培养基平板上活化，28 ℃下培养7 d；然后用已灭菌的打孔器截取已长满菌丝的菌块(Φ=9 mm)，备用。

将5 g剪碎至1～2 cm长的甘蔗叶与7.5 mL的Krik液体培养基搅拌均匀后，装入250 mL的锥形瓶中；121 ℃下灭菌30 min；随即接入已制备好的糙皮侧耳菌块6个，28 ℃下静置培养，湿度保持在60%。从第3天起，每隔4 d测定锥形瓶中样品的木质素含量[5-6]、木质素酶活力、纤维素酶活力，连续监测7次，即第27天结束。本次试验共制作21个样品瓶，每次取样时随机挑选3个样品瓶进行检测，检测结果取平均值。

公式中mn为第n天时的木质素含量，n=3,7,11,15,19,23,27。

木质素酶活力包括漆酶(Lac)[7]、锰过氧化物酶(MnP)[8]和木质素过氧化物酶(Lip)的酶活力[9]。纤维素酶活力包括滤纸酶(FPase)[10]、内切酶(CMCase)[10]、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)[10]和半纤维素酶(Xylanase)[11]的酶活力。

1.3.2 碱处理未灭菌甘蔗叶对糙皮侧耳菌丝生长的影响 取已长满菌丝的菌块(见1.3.1)3个，接入PDA液体培养基，28 ℃下摇瓶(转速为120 r/min)培养7 d后，过滤，获得球状菌丝体，备用。

取30 g剪碎至1～2 cm的甘蔗叶(未灭菌)分别采用质量分数为1% NaOH、1% Ca(OH)2、H2O(对照组)浸泡处理1 h，后用蒸馏水洗至中性，55～60 ℃烘干。随后与45 mL的Krik液体培养基搅拌均匀，装入1 L的烧杯中；按70%的接种量(菌丝体按湿重计算)接入糙皮侧耳菌丝体，并搅拌均匀；最后采用塑料薄膜封口(薄膜上扎孔)，在人工气候箱中28 ℃下静置培养，湿度控制在60%左右，试验设3次重复。连续培养25 d，每天观察糙皮侧耳菌丝的生长情况；并检测分析甘蔗叶在碱处理前、后及第25天甘蔗叶中木质素、纤维素、半纤维素的含量。

1.3.3 糙皮侧耳预处理甘蔗叶的单因素试验设计 糙皮侧耳预处理甘蔗叶单因素试验方法见1.3.2，其中甘蔗叶处理采用1% Ca(OH)2浸泡1 h。针对影响糙皮侧耳菌丝生长繁殖的3个因素：接种量、培养温度、培养湿度，分别进行单因素试验设计。(1)接种量单因素试验：固定培养温度28 ℃、培养湿度60%，分别观察接种量为30%、50%、70%、90%条件下，糙皮侧耳菌丝的萌发及生长情况。(2)培养温度单因素试验：固定接种量70%、培养湿度60%，分别观察培养温度为23、28、33、38 ℃条件下，糙皮侧耳菌丝的萌发及生长情况。(3)培养湿度(相对湿度)单因素试验：固定接种量70%、培养温度28 ℃，分别观察培养湿度为45%、60%、75%、90%条件下，糙皮侧耳菌丝的萌发及生长情况。统计分析试验重复性，即在3次重复中，糙皮侧耳菌丝完全长满甘蔗叶培养基的个数。

1.3.4 糙皮侧耳预处理对甘蔗叶厌氧产沼气特性的影响 甘蔗叶经1% Ca(OH)2浸泡1 h后，接种量按50%比例接入糙皮侧耳菌丝体，在培养湿度60%、28 ℃的条件下静置培养25 d，备用。

取已预处理25 d的甘蔗叶与猪粪混合均匀(控制C∶N=25∶1、固形物含量(TS%)为20%,按接种量30%的比例混入接种污泥，搅拌均匀后装入2 L的厌氧反应瓶。在38 ℃条件下，进行厌氧产沼气试验。以沼气总产量、甲烷含量、木质素降解率为评价指标，并结合日产沼气速率综合评价糙皮侧耳对甘蔗叶的预处理效果。对照组甘蔗叶不作预处理。

2 结果与分析

2.1 糙皮侧耳对已灭菌甘蔗叶的木质纤维素降解能力的测定

糙皮侧耳能够利用甘蔗叶为底物进行生长繁殖，说明其能够分泌木质纤维素降解酶类。从前27 d的酶活力检测数据中发现(表1)：在甘蔗叶培养基上，可检测出3种木质素降解酶活力，且3种木质素降解酶活力均表现出先升高、后降低的变化趋势，其中锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(Lip)的酶活力表现较为突出，在第11天达到产酶高峰，酶活力分别为32.42、46.52 U/g；而漆酶(Lac)的活力表现较弱，在第7天达到产气酶高峰，酶活力仅为2.88 U/g。同时，随着降解时间的延长，甘蔗叶中木质素降解率逐渐提高，在第23天时达到55.31%，随后降解率变化趋于稳定；并且在降解过程中，木质素降解率的增幅与木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)的活力变化存在显著正相关性(图1)，R2分别为0.892、0.629，说明甘蔗叶中木质素的降解主要依赖于上述2种酶。因此，本研究在后续试验中确定糙皮侧耳的预处理周期为25 d。

表1 糙皮侧耳降解甘蔗叶过程中各项指标的检测结果

注：/表示未检测出酶活力。

图1 木质素降解率的增幅与MnP、

此外，3种纤维素酶活力未被检出，而半纤维素酶(Xylanase)在第23天检出，但酶活力较低，为3.1 U/g，表明糙皮侧耳在降解甘蔗叶的前期以木质素降解酶类分泌为主，具有优先降解木质素的能力，这与孙江慧[12]、王宏勋[13]等的试验结论一致。

2.2 碱处理未灭菌甘蔗叶对糙皮侧耳菌丝生长的影响试验

由表2可知，甘蔗叶的碱处理对糙皮侧耳菌丝的生长发育有促进作用，无论是菌丝生长情况还是木质素含量的降低幅度均优于对照组。其中，NaOH+H8处理的影响最为明显，第2天就出现菌丝萌发点；第5天甘蔗叶表面均长满菌丝体，较H8组提前了5 d。Ca(OH)2+H8处理的影响次之，菌丝萌发和长满菌丝体的时间点分别为第3天、第7天。这可能是由于甘蔗叶的物质结构(包括秸秆表面的蜡质层)在碱处理后遭到破坏，强化了糙皮侧耳菌丝在甘蔗叶表面的附着和生长；同时，甘蔗叶表面的土著微生物在碱性环境下又遭受不同程度的抑制或灭活，极大地削弱其对糙皮侧耳菌丝生长的拮抗作用。

对比分析纤维素、半纤维素含量还可发现(表3)：(1)纤维素含量在试验过程中无明显变化，这说明纤维素的稳定结构对碱性环境在短时间内有一定的耐受力；此外，糙皮侧耳在菌丝生长前期，不会产生纤维素降解酶类。(2)半纤维素含量的下降幅度较大，这说明木质素结构在遭到破坏同时，包裹的纤维素和半纤维素得到释放。半纤维素溶于碱性溶液的特性，使其在碱处理过程中，含量发生了不同程度的下降；并在随后的培养过程中被糙皮侧耳菌丝分解利用，因此，第25天的半纤维素含量不足碱处理前的50%。

综合上述分析结果，本研究选择成本更为低廉、环境承载压力更小的Ca(OH)2进行后续试验。主要因素：一是对分析第25天木质素、纤维素和半纤维素含量的差异可知，2种碱处理方式所产生的最终效果无明显差异；二是使用Ca(OH)2带来的环境污染和运行成本远远小于NaOH。

表2 碱处理对糙皮侧耳菌丝生长繁殖的影响

注：+、++、+++分别表示甘蔗叶培养基表面出现5个以下、≥5个、完全长满菌丝萌发点，-表示没有菌丝萌发点。

表3 碱处理对甘蔗叶中木质素、纤维素、半纤维素降解效果的影响

%

2.3 影响糙皮侧耳菌丝生长的单因素试验

由表4可知：当接种量≥50%、培养温度在23～33 ℃、培养湿度在60%～75%时，糙皮侧耳菌丝生长良好，均能在7～10 d长满整个甘蔗叶固体培养基，而且试验重复性好。此外，我国甘蔗主产区地处亚热带地区，预处理甘蔗叶所需的温度(23～33 ℃)和湿度(60%～75%)等条件无需过高能耗即可实现，这表明预处理成本可控，具备规模化应用的潜力。

表4 影响糙皮侧耳菌丝生长的单因素试验结果

注：/表示试验处理未达成目标。试验重复性：在3个试验重复中，菌丝完全长满培养基的个数。

2.4 糙皮侧耳预处理对甘蔗叶厌氧产沼气特性的影响

由表5可知：糙皮侧耳预处理对甲烷平均含量无显著性影响(P>0.05)，但对沼气总产量(33957 mL)和木质素降解率(52.1%)影响比较明显，较对照组分别提高了28.9%、26.2%。

表5 糙皮侧耳预处理甘蔗叶产沼气总产量及甲烷含量

此外，从日产沼气速率数据还可发现(图2)：糙皮侧耳预处理主要影响厌氧发酵过程的前半段(前30 d)，尽管H8和对照两组的日产气趋势基本一致，分别在第7、25天出现2次产气峰。但H8组的日产气量要明显高于对照组，且基本维持在600 mL/d以上，而对照组在2个产气峰之间(第8～22天)出现一个较为明显的产气低谷。这说明糙皮侧耳预处理甘蔗叶可有效地破坏木质素结构，将纤维素和半纤维素提前释放，进而提高发酵物料的利用率，改善了甘蔗叶的厌氧产沼气性能。

图2 糙皮侧耳预处理甘蔗叶对其产沼气特性的影响

3 讨论

产酶试验表明，糙皮侧耳在降解甘蔗叶的前期以木质素降解酶类分泌为主，具有优先降解木质素的能力，符合以厌氧发酵产沼气为目标的预处理工艺需求。厌氧发酵试验也进一步证实：糙皮侧耳预处理，可有效地提高甘蔗叶的利用率和厌氧产沼气能力。预处理条件：甘蔗叶经1% Ca(OH)2浸泡1 h后，接种量按50%比例接入糙皮侧耳菌丝体，在培养湿度60%、28 ℃条件下静置培养25 d，其厌氧发酵产沼气总量为33957 mL、发酵物料的木质素降解率为52.1%，分别较对照组提高了28.9%、26.2%。此外，我国甘蔗主产区地处亚热带地区，预处理甘蔗叶所需的温度和湿度等条件无需过高能耗和特殊设备即可实现，预处理成本可控、适应性广，且具备规模化应用的潜力。

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Pretreatment Technology of Sugarcane Leaf withPleurotusostreatusBased on Anaerobic Biogasification

CHEN Liu-meng1, GUI Lun1, MA Ji-ping1, CHEN Qing-long1,CHEN Kui2, LI Wan-qing3, ZHANG Cheng1*

(1. Institute of Applied Agricultural Microorganism, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. Office of the Mountain-River-Lake Development Committee of Jiangxi Province, Nanchang 330046, China; 3. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, Nanchang 330004, China)

In order to obtain anaerobic fermentation biogas production of sugarcane leaves pretreated byPleurotusostreatus, based on the degradation characteristics ofPleurotusostreatuson sugarcane leaves, the effects of alkali treatment, inoculation amount, temperature, humidity and other factors on the growth of mycelia were studied, determined the pretreatment process, and verified the biogas test by anaerobic fermentation. The results showed that the pretreatment conditions were soaked 1 hour in 1% Ca(OH)2, inoculation amount 50%, culture temperature 28 ℃, and humidity 60%, sugarcane leaves pretreated byPleurotusostreatusfor 25 days, which improved the anaerobic biogasification efficiency, the biogas production was 33957 mL and degradation rate of volatile subtract was 52.1%, which increased by 28.9% and 26.2% respectively compared with the control group.

Anaerobic biogasification;Pleurotusostreatus; Sugarcane leaf; Pretreatment; Technology

2015-09-06

公益性行业(农业)科研专项(201203072)；科技部国际科技合作项目(2012DFA91160、SQ2013Z0C500005)；国家科技支撑

计划项目(2014BAC04B02)；江西省科技厅对外合作技术项目(20141BDH80018)。

陈柳萌(1981─)，男，江西赣州人，副研究员，硕士，主要从事农村能源方面的研究。*通讯作者：张诚。

S216.4

A

1001-8581(2016)03-0082-05

曾小军)