核苷功能菌腺苷超声提取工艺优化

周新虎，陈　翔，严启梅，杨　勇，李　喆，姜　勇，戴　源，谭洪娣，宋　宝（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）



核苷功能菌腺苷超声提取工艺优化

周新虎，陈翔，严启梅，杨勇，李喆，姜勇，戴源，谭洪娣，宋宝
（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

摘要：研究超声波水提法提取核苷功能菌腺苷的最佳工艺。通过单因素试验和正交试验对提取工艺进行优化设计，采用高效液相色谱法测定腺苷含量，考察料液比、超声提取温度、超声提取时间和超声功率对核苷功能菌腺苷含量的影响。得出影响核苷功能菌腺苷提取效果的先后次序为：提取时间＞料液比＞超声功率＞提取温度。最佳提取工艺条件为料液比1/150 g/mL、提取温度55℃、提取时间20 min、超声功率350 W。该工艺条件下，核苷功能菌菌丝体中腺苷含量高达435.58 mg/100 g。

关键词：微生物；核苷功能菌；腺苷；超声提取法；正交试验设计

核苷功能菌，泛指能够代谢生成核苷及其类似物的一类微生物，据研究，核苷功能菌可以代谢生成核苷及其类似物、多糖类、D-甘露醇等成分，其中腺苷是核苷功能菌主要活性成分，也是调节睡眠的内稳态因子之一，对人体代谢和生理功能起到重要调节作用[1-3]。

目前，常用高效液相色谱法来检测腺苷含量，但对于核苷功能菌中腺苷的前处理方法，没有系统性的研究报道。据相关研究，不同提取方法对腺苷的提取，超声法的效果远远高于回流法和振荡法；不同提取溶剂（甲醇、乙醇、水）对腺苷提取效果的影响，采用纯水提取时腺苷的提取效果最好，杂质干扰少。本实验结合已有的研究结果，采取超声提取法，以水为提取溶剂，从料液比、提取温度、提取时间和超声功率4个因素优化核苷功能菌中腺苷的前处理，为快速准确测定核苷功能菌中的腺苷含量提供理论参考依据。

1　材料与方法

1.1材料

实验菌种：本公司技术中心功能微生物实验室保藏。

1.2耗材及仪器

实验耗材：腺苷标准品，纯度100 mg/L，sigma试剂公司生产；磷酸二氢钾（分析纯），国药集团化学试剂有限公司生产；甲醛（色谱纯），德国merck公司提供；等。

实验仪器：真空冷冻干燥机，FD-1C-50型，北京博医康实验仪器有限公司；冰箱，BCD-649WE型，青岛海尔股份有限公司；台式低速离心机，AXTD5A型，盐城市安信实验仪器有限公司；电子天平，AL204型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高效液相色谱，HPLC-e2695，美国waters高效液相色谱仪；二极管阵列检测器，岛津公司；一次性使用无菌注射器带针，圣光医用制品有限公司；wondaDisc水系针头滤器MCE25 mm×0.45 μm，岛津技迩（上海）商贸有限公司；Millpore超纯水系统；KH-500DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1菌丝体预处理[4]

将液体深层发酵获得的核苷功能菌菌丝体经真空冷冻干燥后，粉碎，过80目筛，封口袋保存备用。

1.3.2标样溶液的制备

准确量取一定体积的100 mg/L的腺苷置于10 mL容量瓶，用超纯水溶液溶解定容，分别配制成质量浓度（mg/L）为5、10、15、20、25、30、35、40的腺苷溶液，作为标样溶液。

1.3.3菌丝体中腺苷的超声提取方法

准确称取一定量的已预处理的菌丝体粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超纯水，按试验设定条件超声提取腺苷，用超纯水定容（腺苷粗提液），振荡摇匀，以4000 r/min离心5 min，再经0.45 μm微孔滤膜过滤，所得滤液即为菌丝体中腺苷提取液，进行HPLC分析。

1.3.4腺苷的测定方法[5-6]

利用HPLC法测定核苷功能菌菌丝体中腺苷的含有量。流动相为pH6.5的磷酸盐缓冲液-甲醇(体积比85∶15)；色谱柱为C18，体积流量1 mL/min，检测波长260 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

1.3.5菌丝体中腺苷提取率的计算

腺苷提取率（mg/100g）=腺苷含量(mg/L)×腺苷粗提液体积（mL）×1000/菌丝体质量(g)×100。

1.3.6单因素提取试验设计

分别以不同的料液比、提取温度、提取时间、超声功率作为单因素试验影响因子，考察各单因素对核苷功能菌菌丝体中腺苷含量的影响。

1.3.7超声提取工艺正交试验

根据试验结果，选择料液比、提取温度、提取时间、超声功率4个因素，各取3个水平，采用L9(34)正交表进行正交试验，见表1。

表1 超声提取腺苷正交试验因子及水平

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1料液比对腺苷提取效果的影响

按照不同的料液比（g/mL）1/50、1/100、1/150、1/200、1/250，称取适宜的核苷功能菌丝体粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超纯水摇匀，于50℃、350 W条件下超声20 min，冷却，用超纯水定容至刻度，振荡摇匀，以4000 r/min离心5 min，再经0.45 μm微孔滤膜过滤，所得滤液进行HPLC分析，结果见图1。

图1 料液比对腺苷提取效果的影响

由图1结果表明，不同料液比对腺苷的提取效果有影响，料液比大，提取效果好。当料液比达到1/150 g/mL时提取效率达到最大值，为402.50 mg/100 g，当料液比为1/200 g/mL时腺苷含量为393 mg/100 g，与料液比1/150 g/mL相比，降低2.36 %，考虑节约提取溶剂，降低提取成本，建议选择料液比1/150 g/mL。

2.1.2提取温度对腺苷提取效果的影响

按照1/150的料液比（g/mL）称取适宜的核苷功能菌菌丝体粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超纯水摇匀，分别于温度45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，超声功率为350 W条件下超声20 min，冷却，用超纯水定容至刻度，振荡摇匀，以4000 r/min离心5 min，再经0. 45 μm微孔滤膜过滤，所得滤液进行HPLC分析。

图2 提取温度对腺苷提取效果的影响

温度对超声波提取核苷功能菌丝体粉中腺苷的影响结果见图2。提高温度有利于提取腺苷，但温度过高会使腺苷提取效果变差，腺苷的热稳定性也随之变差，因此过高的温度可能会影响腺苷的提取效果。从图2可以看出，超声提取温度为55℃时，腺苷含量达到最大值422.66 mg/100 g，温度继续升高时，腺苷含量出现下降趋势，因此超声最佳提取温度为55℃。张娜等[7]研究指出，随着超声提取温度的升高，白囊耙齿菌丝体中腺苷提取率先升高后降低，本研究结论与其相似。

2.1.3提取时间对腺苷提取效果的影响（图3）

按照1/150的料液比（g/mL）称取适宜的核苷功能菌菌丝体粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超纯水摇匀，以50℃、350 W条件下分别超声10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，冷却，用超纯水定容至刻度，振荡摇匀，以4000 r/min离心5 min，再经0.45 μm微孔滤膜过滤，所得滤液进行HPLC分析。

图3 提取时间对腺苷提取效果的影响

超声提取时间越长，核苷功能菌丝体细胞破碎越充分，细胞内含物质渗出越多，腺苷提取液中水溶性成分含量增加，达到一定时间，绝大多数水溶性成分即可全部提出；但随着时间的延长，不但细胞破碎率不会提高，甚至会对细胞中生物分子有破坏作用，增加了提取液中干扰物质的量，加大了检测分析的难度[6]。本实验结果表明，随着提取时间的延长，腺苷的含量明显增加。当提取时间为20 min时，腺苷含量达到最高值，超过25 min后，腺苷含量降低。为提高腺苷提取效率，建议选择超声提取20 min为最佳时间。

2.1.4超声功率对腺苷提取效果的影响

按照1/150的料液比（g/mL）称取适宜的核苷功能菌丝体粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超纯水摇匀，于温度55℃、不同超声功率（W）250、300、350、400、450条件下超声20 min，冷却，用超纯水定容至刻度，振荡摇匀，以4000 r/min离心5 min，再经0.45 μm微孔滤膜过滤，所得滤液进行HPLC分析（见图4）。

图4 超声功率对腺苷提取效果的影响

由图4可知，当超声功率在200～400 W范围内，随着超声功率的增大，腺苷含量先增加后降低。当超声功率为350 W时，腺苷含量达到最大值423.89 mg/100 g；当超声功率为400 W时，腺苷含量反而降低，可能是由于超声波的强烈空化效应使腺苷结构破坏，导致提取率降低。因此，超声功率为350 W时，较有利于核苷功能菌丝体中腺苷的提取。

2.2正交试验结果（表2）

表2 正交试验及结果

由表2中R值可知，影响核苷功能菌腺苷含量的先后顺序是C＞A＞D＞B，即最重要的因素为超声作用时间，其次是料液比，再次是超声功率，最后是提取温度。最佳组合为A2B2C3D1，即提取工艺参数为料液比1/150 g/mL、提取温度55℃、提取时间25 min、超声功率300 W。将此结果与单因素试验筛选出的最佳条件组合分别进行验证试验，试验结果见表3。

表3 验证试验结果(n=3)

由表3验证试验结果可知，核苷功能菌腺苷超声提取的最佳工艺组合为A2B2C2D2，即料液比1/150 g/mL、提取温度55℃、提取时间20 min、超声功率350 W，得到核苷功能菌腺苷最高值435.58 mg/100 g，RSD为1.23 %。

2.3超声提取法与常规提取法的比较

准确称取一定量预处理后的核苷功能菌粉末，固定料液比、提取温度（室温浸提除外），适当延长室温浸提和热浸渍法的提取时间，测定3种提取法核苷功能菌腺苷的含量，试验条件及结果见表4。

表4 超声提取法与常规提取法的比较

由表4可知，超声提取法较常规提取法有较大优势，腺苷含量分别高于常规提取法室温浸提法的157.8 %，热浸提取法的9.18 %，而且缩短了整个工艺的提取时间，为工业化生产提供了参考依据。

3　结论

本实验通过单因素试验和正交试验，采用超声法提取核苷功能菌腺苷含量。实验结果表明，影响超声提取核苷功能菌腺苷含量的4个因素先后顺序为超声提取时间＞料液比＞超声功率＞提取温度。得到的最佳工艺参数为料液比1/150 g/mL、提取温度55℃、提取时间20 min、超声功率350 W。在该条件下核苷功能菌腺苷含量435.58 mg/100 g，RSD为1.23 %。与常规提取方法相比，超声提取法简单易行、效率高、提取时间短，是一种提取核苷功能菌腺苷的有效途径，具有推广应用的价值。

参考文献：

[1]张元杰,钱正明,陈肖家. HPLC法同时测定补益中药中尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量[J].药物分析杂志,2010, 30(1)：33-36.

[2]江元翔,高淑红,陈长华.响应面设计法优化腺苷发酵培养基[J].华东理工大学学报：自然科学版,2005,31(3)：309-313.

[3] Cui F L, Wang J L, Cui Y R, et al. Investigation of interaction between human serumalbumin and N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine by fuorescence spectroscopy and molecular modelling[J]. Luminescence 2007,22：546-553.

[4]张娜,郭娇,季文彬,等.响应面法优化白囊耙齿菌中腺苷的超声法提取工艺[J].中国医药工业杂志,2011,42(2)：100-103.

[5]张命龙,焦春伟,谢意珍,等.蝙蝠蛾拟青霉液体发酵工艺优化及菌丝体腺苷含量的检测[J].菌物学报,2016,35(1)：1-14.

[6]张博,杨黎彬,李金娟.高效液相色谱法测定拟青霉中活性成分腺苷的含量[J].今日药学,2011,21(2)：25-26.

[7]张娜,周卫,王文溪,等.响应面法优化白囊耙齿菌中腺苷的提取工艺[J].中国生化药物杂志,2011,32(5)：370-373.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Adenosine from Nucleoside Functional Bacteria

ZHOU Xinhu, CHEN Xiang, YAN Qimei, YANG Yong, LI Zhe, JIANG Yong, DAI Yuan, TAN Hongdi and SONG Bao
(Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800, China)

Abstract:The ultrasonic-assisted extraction conditions of adenosine from nucleoside functional bacteria were optimized by single factor test and orthogonal experiments. Adenosine content was measured by HPLC. The effects of solid-liquid ratio, extraction temperature, ultrasonic extraction time and ultrasonic power on adenosine content were investigated. The factors influencing adenosine extraction ranked in decreasing sequence as follows: extraction time>solid- liquid ratio>ultrasonic power>extraction temperature. The optimum technical parameters were summed up as follows: solid-liquid ratio was 1/150 g/mL, extraction temperature at 55℃, ultrasonic extraction time was 20 min, and ultrasonic power was 350 W. Under above conditions, the content of the extracted adenosine from nucleoside functional bacteria reached up to 435.58 mg/100 g.

Key words:microbe; nucleoside functional bacteria; adenosine; ultrasonic-assisted extraction; orthogonal experiments design

作者简介：周新虎（1962-），男，江苏宿迁人，汉族，硕士，高级工程师，江苏洋河酒厂股份有限公司副总裁、总工程师，白酒国家评委，中国首席品酒师、中国评酒大师，曾获全国五一劳动奖章，江苏省突出贡献专家等荣誉称号。

收稿日期：2015-12-16

DOI：10.13746/j.njkj.2015468

中图分类号：TS262.3；Q93-3；TS261.1；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016)04-0070-04

优先数字出版时间：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1542.005.html。